Набір моноклональних антитіл м3, м5, м6, м8, специфічних до імуноглобулінів людини класу м, придатних до використання у імуноферментному аналізі

УКРАЇНА (19) UA (11) 16039 (13) U (51) МПК (2006) C12N 5/00 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА КОРИСНУ МОДЕЛЬ видається під відповідальність власника патенту (54) НАБІР МОНОКЛОНАЛЬНИХ АНТИТІЛ М3, М5, М6, М8, СПЕЦИФІЧНИХ ДО ІМУНОГЛОБУЛІНІВ ЛЮДИНИ КЛАСУ М, ПРИДАТНИХ ДО ВИКОРИСТАННЯ У ІМУНОФЕРМЕНТНОМУ АНАЛІЗІ 1 2 Характеристика моноклональних антитіл Назва МКАТ М3 М5 М6 М8 Ізотип антитіл IgG, IgG, IgG, IgGi Константа афінності, х1010 моль/л 1,5 1,0 1,2 1,0 Титр антитіл у культураль- Титр пероксидазного кон'юганій рідині* ту МКАТ** 1:1000 1:50000 1:800 1:800 1:1000 *тестування у непрямому твердофазному ІФА на IgM людини (сорбція 0,5мкг/мл) **тестування у прямому твердофазному ІФА на IgM людини (сорбція 0,5мкг/мл) Приклад 1. Одержання та очистка моноклональних антитіл із асцитичної рідини. Для нагромадження значної кількості МКАТ гібридоми-продуценти певних антитіл культивували у черевних порожнинах мишей. Для цього за 10-14 (13) 16039 Таблиця (11) У порівнянні із вищезгаданим антитілами клони М3, М5, М6, М8 характеризуються більшою специфічністю та активністю у імуноферментному аналізі. Моноклональні антитіла продукуються гібридними клітинами, що одержані при злитті мієломних мишачих клітин Sp 2/0 та спленоцитів мишей лінії Balb/c. Характеристики клонів МКАТ М3, М5, М6, М8 наведені у таблиці. Клон МКАТ М3 придатний для використання у імуноферментних тестсистемах у вигляді пероксидазного кон'югату, а клони МКАТ М5, М6 та М8 - у складі імуносорбенту. UA Корисна модель стосується імунохімії та гібридомної технології і може бути використаний для одержання моноклональних антитіл (МКАТ) до імуноглобулінів людини класу М та їхніх імуноферментних кон'югатів. Метою корисної моделі є одержання нових моноклональних антитіл до IgM людини, придатних для використання у імуноферментному аналізі (ІФА). Відомі МКАТ до імуноглобулінів людини класу М [1]. Проте згадані моноклональні антитіла непридатні для використання у імуноферментних тест-системах для серологічної діагностики. Найбільш близьким до запропонованих є моноклональні антитіла, які взаємодіють із IgM людини [2]. U (57) Набір моноклональних антитіл М3, М5, М6, М8, специфічних до імуноглобулінів людини класу М, придатних до використання у імуноферментному аналізі, який характеризується тим, що моноклональні антитіла набору мають високі константу афінності, титр у культуральній рідині, титр пероксидазного кон'югату. (19) (21) u200601615 (22) 16.02.2006 (24) 17.07.2006 (46) 17.07.2006, Бюл. № 7, 2006 р. (73) ТОВАРИСТВО З ОБМЕЖЕНОЮ ВІДПОВІДАЛЬНІСТЮ "НАУКОВО-ВИРОБНИЧА КОМПАНІЯ "ВІТРОТЕСТ" 3 16039 4 днів до ін'єкції клітин мишам вводили внутрішньоОдержаний розчин пероксидазного кон'югату черевне по 0,5мл пристану. Мінеральне масло МКАТ переводили у 0,02М фосфатний буфер з служило сильним стимулятором асцитоутворення. 0,15М NaCI шляхом діалізу. Потім вводили від 106 до 107 гібридом-продуцентів Приклад 3. Спосіб використання моноклонаМКАТ в 1мл середовища. Через 5-8 днів у мишей льних антитіл М5, М6 та М8 у складі імуносорбенпочинала накопичуватися рідина в черевній пороту жнині. Її відбирали шляхом проколювання черевСорбцію МКАТ у полістиролових планшетах ної стінки товстою голкою. З однієї миші за кілька проводили у 0,05М карбонат-бікарбонатному буразів вдавалося отримати від 5 до 10мл асцитичфері (рН9,6) протягом ночі при 4°С в концентрації ної рідини. Після центрифугування при 3000об/хв. 5мкг/мл. Для відмивання використовували фосфана протязі 5 хвилин асцит зберігали в заморожетно-сольовий буфер з додаванням 0,05% твін-20 ному стані. (ФСБТ), рН7,2-7,4. У лунки планшету вносили досАнтитіла, що знаходяться в асциті, осаджуваліджувані зразки сироваток крові. Планшет інкубули сульфатом натрію (18% та 16%), розчиняли у вали 1 годину при 37°С і потім відмивали. Для видистильованій воді, переосаджували сульфатом явлення зв'язаних антитіл використовували амонію (50%) та розчиняли у мінімальній кількості кон'югат рекомбінантних білків антигенів вірусу води. червонички з пероксидазою хрону, який інкубували Приклад 2. Спосіб одержання кон'югату моно1 годину при кімнатній температурі. Планшет тричі клональних антитіл МЗ з пероксидазою хрону. відмивали ФСБТ і один раз водою. Як субстрат Кон'югацію МКАТ з пероксидазою хрону здійсвикористовували 0,003 % розчин перекису водню нювали у співвідношенні антитіл до ферменту 2:1 в 0,15М цитратному буфері, рН5,0, а як хромоген (масові долі) методом періодатного окислення за тетраметилбензидін. Реакцію зупиняли 2М сірчаР.Tijssen [3] із власними модифікаціями. ною кислотою. Оптичну щільність при довжині При окисленні пероксидазу хрону розчиняли у хвиль 492нм і 630нм вимірювали на спектрофото0,1М бікарбонатному буфері, рН8,3, до концентраметрі. ції 15мг/мл та додавали такий же об'єм 14мМ водПерелік літературних джерел: ного розчину періодату натрію. Суміш інкубували 1. Shao Z., Xu D., Li J. et al. Detection of antiпротягом 2 годин при кімнатній температурі. ОдеHAV antibody with dot immunoglobulin filtration assay ржаний таким чином розчин активованої перокси// World J. Gastroenterol. - 2003. - Vol.9. - P.1508дази додавали до розчину антитіл, які попередньо 1511. діалізували проти 0,1М карбонатного розчину, 2. Ramskill S., Senior P., Barlow P. et al. Enzyme рН9,2. Суміш переносили у герметичну хроматогlinked immunosorbent assay (ELISA) for рафічну колонку та додавали 1/3 частину сухого cytomegalovirus antibody in donor plasma // J. Clinic. сефадексу G-25, інкубували протягом 3 годин при Pathol. - 1988. - Vol.41. - P.1233-1235. кімнатній температурі. 3. Tijssen P. Preparation of enzyme-antibody or По закінченні інкубації, розчин кон'югату елюenzyme-macromolecule conjugates // Laboratory ювали з колонки та зупиняли реакцію додаванням techiques in biochemistry and molecular biology: 1/20 об'ємні частини водного розчину NaBН4 practice and theory of enzyme immunoassays / (5мг/мл), залишаючи на 30хв. при кімнатній темпеEditors R.H. Burdon, P.H. van Knippenberg. ратурі. Після цього ще додавали 3/20 частини розAmsterdam: Elsevier, 1985. - P.221-241. чину боргідриду натрію, інкубували протягом 60хв. Комп’ютерна верстка В. Мацело Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601