Спосіб отримання трансформованих рослин ряски методом а. rнizogenes-опосередкованої трансформації

Реферат: Спосіб отримання трансформованих рослин ряски методом А. rhizogenes-oпoceредкованої трансформації включає використання бактерій A. rhizogenes. Як експланти для трансформації використовують культивовані in vitro рослини ряски без додаткових етапів калусоутворення та регенерації рослин. Трансформацію здійснюють за допомогою дикого штаму А. rhizogenes A4. UA 69446 U (12) UA 69446 U UA 69446 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології та генетичної інженерії і стосується способу отримання трансформованих рослин ряски методом агробактеріальної трансформації. Ряска Lemna minor L. - водна рослина, що належить до родини Lemnaceae класу однодольних. У рослин відсутні стебло та листки, організм являє собою фотосинтезуючу пластинку - листець з боковими листецями та корінець (корінці). Ряска швидко розмножується вегетативним шляхом, при якому з пазух листеців (кармашків) утворюються нові пагони, які потім відділяються від материнської рослини Рослини родини Lemnaceae є стійкими до високих концентрацій токсичних сполук. Вони здатні очищувати воду від гербіцидів, важких металів, органічних сполук. Виходячи з цих особливостей, ряска та інші види можуть використовуватися для біомоніторингу та фіторемедіації забруднених водойм. В народній медицині ряску використовують як спазмолітичний жарознижувальний, сечогінний, антимікробний засіб завдяки наявності флавоноїдів, каротиноїдів та інших сполук. З ряски виділено полісахарид лемнан, який має імуномоделюючі властивості. Ряска містить до 35 % білка (для порівняння - сухе насіння сої містить 38-42 %). Виходячи з цього, її використовують як кормову добавку у тваринництві та птахівництві. Крім того, оскільки рослина містить багато білку, швидко розмножується, а отримання біомаси не вимагає значних фінансових витрат, вона є ідеальним об'єктом для генноінженерних досліджень з метою створення трансгенних рослин - продуцентів рекомбінантних білків, зокрема цінних фармацевтичних сполук. Використання генетично-модифікованих ряскових як біофабрики дозволяє синтезувати рекомбінантні білки у великих кількостях з низькою собівартістю, а отримані білки є більш безпечними, ніж рекомбінантні білки бактеріального чи тваринного походження, оскільки в цьому випадку є ймовірність забруднення екстрагованого продукту вірусами або іншими патогенами. Зазвичай для отримання трансгенних рослин ряски використовують методи трансформації, в яких як експланти (об'єктів) використовують калусну тканину ряски, а також бактерії Agrobacterium tumefaciens. Найбільш близьким є спосіб Agrobacterium tumefaciens-опосередкованої трансформації калусних тканини ряски, який включає поверхневу стерилізацію рослин, культивування на живильних середовищах з регуляторами росту, ініціювання та підтримання в культурі in vitro калусних тканин, кокультивування в нарощеній суспензії агробактерій, застосування спеціальних сигнальних сполук, відмивання експлантів, розміщення їх на селективному середовищі, селекцію стійких до селективного антибіотику (канаміцину калусних клонів, отримання рослин-регенерантів (див. Гайдукова С.Е., Ракитин А.Л., Равин Н.В., Скрябин К.Г., Камионская A.M. Разработка системы генетической трансформации ряски малой Lemna minor) ІІ Экол. генет.-2008. - Т.6, N 4 -С. 13-15.; Sun Y., Cheng J.J., Himmel M. E., Skory CD., Adney W.S., Thomas S.R., Tisserat B, Nishimura Y., Yamamoto Y.T. Expression and characterization of Acidothermus cellulolyticus El endoglucanase in transgenic duckweed Lemna minor 8627 // Bioresour. Technol.-2007. - V. 98, N. 15. - P. 2866-2872. De Leede L.G., Humphries J.E., Bechet A.C., Van Hoogdalem E.J., Verrijk R., Spencer D.G. Novel controlled-release Lemna-derived IFNalpha2b (Locteron): pharmacokinetics, pharmacodynamics, and tolerability in a phase I clinical trial // J. Interferon Cytokine Res.-2008. - V. 28, N. 2. - P. 113-122.; Stomp A.-M., Rajbhandah N. Genetically engineered duckweed // United States Patent 6040498, Application Number: 09/132536 Publication Date: 03/21/2000). Недоліком найближчих аналогів є те, що як експланти використовують калусні тканини ряски. Це обумовлює, по-перше, двоетапність процесу отримання трансгенних рослин (етап отримання калусної тканини та етап регенерації рослин), що значно збільшує час, який необхідний для отримання трансгенних рослин, а також збільшує витрати (реактиви та оплата праці); по-друге, виникає необхідність роботи з неоднорідною в генетичному відношенні популяцією клітин. Крім того, у аналогах застосовували специфічні сигнальні сполуки (ацетосерингон) або клітинну суспензію дводольних рослин (наприклад, 1-10 % суспензію клітин Nicotiana tabacum). В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб отримання трансформованих рослин ряски методом агробактеріальної трансформації, в якому, шляхом заміни експлантів - калусних тканин на листові експланти досягається спрощення процесу отримання трансгенних рослин, скорочення часу, отримання при генетично однорідних клонів рослин. Для вирішення поставленої задачі запропоновано спосіб отримання трансформованих рослин ряски методом агробактеріальної трансформації, який включає поверхневу стерилізацію 1 UA 69446 U 5 10 15 20 25 рослин з природної популяції, кокультивування спочатку в нарощеній суспензії агробактерій, потім на агаризованому середовищі, відмивання експлантів, розміщення їх на селективному середовищі та подальшому вегетативному розмноженню рослин-регенерантів, за яким, згідно з корисною моделлю, як рослинні експланти для трансформації використовують безпосередньо рослини культивованих in vitro рослин ряски. До переваг даного способу можна віднести виключення необхідності отримання калусних тканин ряски, значне скорочення часу, що необхідний для створення трансформованих рослин, зменшення фінансових витрат на процес отримання рослин з трансформованим геномом, можливість роботи з однорідною в генетичному відношенні популяцією рослин. Конкретний приклад виконання способу. Рослинний матеріал. Поверхню рослин ряски з природної водойми стерилізували протягом 1 хв. у 70 % етанолі, 1-10 хвилин у розчині комерційного препарату "Білизна" (НПФ "Біолайт", Україна) та промивали стерильною дистильованою водою (60 хв.). Після стерилізації рослини вирощували у чашках Петрі на агаризованому середовищі 1/2 МС - середовище Мурасіге та Скуга (MS-Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant.-1962.-15. - P. 473-497) зі зменшеним вдвічі вмістом мікроелементів - при 16-годинному світловому фотоперіоді та температурі 24 °C. Agrobacterium rhizogenes-опосередкована трансформація ряски. Для агробактеріальної трансформації Lemna minor використовували рослини ряски. Рослини інкубували в бактеріальній суспензії 30 хв., промокали фільтровальним папером та культивували протягом двох діб на середовище ½ МС. Потім експланти переносили на середовище ½ МС, до якого додано 25 мг/л канаміцину та 600 мг/л цефатоксиму. Отримані рослини вирощували на безгормональному агаризованому середовищі ½ MS з 25 мг/л канаміцину. Плазміди і бактеріальний штам. В роботі використовували векторну конструкцію рСВ 158 (показано на рисунку), яка містила злиту послідовність генів esxA::fbpBTMD, що кодують антигени ESAT6 та Ag85B (без трансмембранного домену TMD) з Mycobacterium tuberculosis, під контролем Мll промотору та селективний ген неоміцинфосфотрансферази II nptll. Загальну схему конструкцій можна представити як LB-Nos Pro-nptll-Nos ter-Mil pro - esxA::fbpBTMD -Ocs terRB. 30 35 40 45 50 55 Аналіз за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Інтеграцію чужорідних генів в рослинний геном визначали за допомогою ПЛР. Геномну ДНК виділяли із асептичних рослин ЦТАБ-методом (Дрейпер Дж., Скотт Р. Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений. В кн. Генная инженерия растений. М.: Мир, 1991.- С.241-245.). Сумарну ДНК з агробактерій, яку використовували як позитивний контроль в ПЛР, екстрагували за методикою 9 Армитидж Ф., Уолден Р., Дрейпер Дж. Выделение тотальных препаратов нуклеиновых кислот из A. tumefaciens В кн. Генная инженерия растений. М.: Мир, 1991. - С. 76-78.). ПЛР геномної ДНК проводили на ампліфікаторі Mastercycler personal 5332 (Eppendorf). Реакційна суміш складалася з однократного ПЦР-буфера з сульфатом амонію, 0,2 мкМ відповідних праймерів, 200 мкМ кожного з дезоксинуклеотидтрифосфатів, 0,5 од. Taq-полімерази, 10-50 нг ДНК-проби. Загальний об'єм реакційної суміші складав 20 мкл. При цьому використовували праймери, специфічні до кодуючої частини генів nptll (5'-cctgaatgaactccaggacgaggca-3', 5'gctctagatccagagtcccgctcagaag-3', 622 п.н), esxA (5'-ctgaccatggcagagcagcagtggaatttcgc-3', 5'gagaattctgcgaacatcccagtgctcg-3', 299 п.н.), fbpBTMD(5'-tctacagcgactggtacagc-3', 5'tcaggttgctgctacgaacg-3', 484 п.н.) та rolB (5'-atggatcccaaattgctattccttccacga-3', 5'ttaggcttctttcttcaggtttactgcagc-3', 780 п.н.). Умови ампліфікації: первинна денатурація - 94 C, 3 хв., потім 30 циклів амліфікації (94 °C, 30 сек. - 62°C, 30 сек. - 72 °C, 30 сек.), кінцевий синтез - 72 С, 3 хв. Для детекції rolB в циклах ампліфікації тривалість синтезу була дещо довша - 40 сек. (72 °C). Фрагменти ДНК, отримані в результаті полімеразної ланцюгової реакції, аналізували за допомогою електрофорезу в 1,5 %-ному агарозному гелі в трис-ацетатній буферній системі. Результати. В результаті експериментів отримано 2 канаміцинстійкі лінії ряски. Процес росту нових листеців з кармашків експлантів, підданих трансформації, розпочинався через 2-3 дні. Через 2 тижні було відібрано 2 клони, листеці яких мали зелене забарвлення на селективному 2 UA 69446 U 5 10 15 середовищі, що ставило 2 % від загальної кількості експлантів. Рослини розмножували шляхом відокремлення та вирощували протягом 3 місяців на селективному середовищі. Відібрані при селекції рослини за розмірами, морфологією не відрізнялися від контрольних нетрансформованих рослин. Вони так само утворювали нові листеці та мали по одному корінцю довжиною до 10 мм. В наших дослідах відсутність появи коренів специфічного фенотипу ("бородатих коренів") можна пояснити тим, що в процесі трансформування рослин ряски не відбулося перенесення rol генів А. rhizogenes до рослинного геному, що і було підтверджено ПЛР-аналізом трансформованих клонів. Ампліфікація сумарної ДНК з використанням праймерів, специфічних до гена rolB, який поряд з іншими генами rol-локуса задіяний в процесі коренеутворення і відповідає за фенотип "бородатих коренів", не виявила фрагменту очікуваного розміру (780 п н.). Аналіз ДНК рослин ряски на присутність селективного та цільового генів показав наявність як селективного, так і цільових генів. Таким чином, дійсно відбулося перенесення селективного та цільових генів до рослинних клітин. Таким чином, розроблений спосіб трансформації ряски за допомогою A. rhizogenes A4 з використанням як експлантів рослин, культивованих in vitro. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб отримання трансформованих рослин ряски методом А. rhizogenes-oпoceредкованої трансформації, що включає використання бактерій A. rhizogenes: кокультивування рослин в суспензії агробактерій, розміщення на селективному середовищі та вегетативне розмноження, який відрізняється тим, що як експланти для трансформації використовують культивовані in vitro рослини ряски без додаткових етапів калусоутворення та регенерації рослин, трансформацію здійснюють за допомогою дикого штаму А. rhizogenes A4 та не застосовують будь-які допоміжні сполуки. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3