Спосіб видалення l-триптофану з крові хворих зі злоякісними новоутвореннями

Реферат: Спосіб видалення L-триптофану з крові хворих зі злоякісними новоутвореннями з використанням сорбенту, причому використовуються гемосорбенти гранульовані 3 делігандизуючі (ГСГД) з об'ємом сорбційних пор за бензолом не нижче 1,5 см /г та насипною 3 вагою не більше ніж 0,190 г/см , що покриваються сироватковим альбуміном людини, який перед іммобілізацією на ГСГД піддається сорбційній делігандизації UA 69817 U (12) UA 69817 U UA 69817 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Корисна модель, що заявляється, належить до медицини, а саме до онкології. Можливість гальмування пухлинного росту шляхом формування в організмі дефіциту Lтриптофану (L-Tp) [1-3] стала відправним пунктом для розробки підходів до його екстракорпоральної деплеції. Відомо спосіб екстракорпоральної деплеції L-Tp, в основі якого лежить використання колонки з деградуючим L-Tp ферментом - оксидазою бокового ланцюга L-Tp, ізольованої з Pseudomonas XA і пришитою за допомогою глутарового альдегіду до поліакрил-целюлозного кополімеру або гамма-аміносиланкремнезему [4, 5]. Недоліками способу є: складність і наявність трудомістких і дорогих технологічних прийомів, що пов'язані з виділенням й очищенням триптофан-деградуючого ферменту, активація за допомогою глутарового альдегіду полімерних матриць для іммобілізації ферменту; крім того, за допомогою екстракорпорального ферментативного розщеплення L-Tp важко забезпечити необхідний обсяг його деградації в умовах організму, тому додатково використовується триптофанзбіднена дієта. Вибраний як показник рівня техніки і водночас як прототип спосіб екстракорпоральної деплеції L-Tp у процесі гемокарбоперфузії у онкологічних хворих [6]. Цей спосіб є найбільш близьким по технічній суті до способу, що заявляється, і полягає у використанні як сорбенту для екстракорпоральної деплеції L-Tp з крові онкологічних хворих циліндричного активованого вугілля, покритого ацетат-целюлозною плівкою (фірма "Gambro", Швеція). Основний недолік цього способу полягає у низькому рівні вилучення L-Tp під час контакту крові з гемосорбентом, що обумовлено як низькими поглинальними властивостями активованого вугілля, яке використовується, так і зниженням його сорбційної ємкості внаслідок покриття інертною ацетатцелюлозною плівкою, призначеною для підвищення гемосумісності вугілля. В основу корисної моделі поставлено задачу забезпечення в процесі гемокарбоперфузії ефективного вилучення L-Tp і низького рівня поглинання білка на фоні високої сумісності з кров'ю сорбенту, що використовується, для отримання способу видалення L-Триптофану з крові хворих зі злоякісними новоутвореннями, придатного для суттєвого збільшення рівня вилучення L-Tp під час гемокарбоперфузії. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак способу, що заявляється, та технічним результатом корисної моделі наступний. Задача екстракорпорального видалення L-Tp, 80 % якого у крові зв'язано з альбуміном, потребує використання сорбенту, що здатний забезпечити швидку кінетику масообміну, необхідну для підтримання у крові практично постійної нульової концентрації білокзв'язаного метаболіту. Поставлена задача вирішується завдяки використанню як гемосорбенту вуглецевих мас-фрактальних пірополімерів - ГемоСорбентів Гранульованих Делігандизуючих (ГСГД) з 3 об'ємом сорбційних пор за бензолом (Vs) не нижче 1,5 см /г та насипною вагою (НВ) не більше 3 ніж 0,190 г/см (Свідоцтво про державну реєстрацію №9267/2010 від 10.12.2010 p.). У табл.1 наведені дані порівняльної оцінки ефективності вилучення L-Tp із модельного альбумінвмісного розчину вуглецевими адсорбентами. Тест-система: альбумінвмісний (30 мг/мл) натрій-фосфатний буферний розчин (рН 7,2) L-Tp (11,6 мг/мл), об'єм розчину - 5 мл, об'єм сорбенту - 0,5 мл, час адсорбції - 4 год. Адсорбція проводиться в умовах шутельного експерименту. Оцінюється ступінь поглинання L-Tp із тест-системи (у % від вихідної концентрації) та величина адсорбції L-Tp на 1 г сорбенту. Таблиця 1 Порівняльна оцінка ефективності вилучення L-Tp із модельного альбумінвмісного розчину вуглецевими адсорбентами Сорбент Активоване вугілля, покрите ацетатцелюлозною плівкою, 3 3 Vs - 0,45 см /г, НВ - 0,44 г/см ГСГД, 3 3 Vs - 1,50 см /г, НВ - 0,19 г/см гсгд, 3 3 Vs - 0,098 см /г, НВ - 2,50 г/см 45 Поглинання L-Tp, % Адсорбція L-Tp, мг/г 36,7 96,6 92,5 564,7 96,2 945,7 За даними, наведеними у табл.1, видно, що поглинальна здатність у відношенні до L-Tp активованого вугілля, покритого ацетат-целюлозною плівкою, яке вибрано як прототип, у 5,8-9,8 разів нижча, ніж гемосорбентів ГСГД, які використовуються у корисній моделі, що заявляється. 1 UA 69817 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Задача зниження адсорбції білка під час гемокарбоперфузії та одночасного підвищення гемосумісності ГСГД вирішується за допомогою покриття ГСГД сироватковим альбуміном людини (САЛ). Для того, щоб мінімізувати втрату сорбційної активності у відношенні до L-Tp як покриття використовується делігандизований САЛ, що отримують шляхом сорбційної делігандизації донорського САЛ і який має суттєво підвищену акцепторну ємкість щодо білокзв'язаних метаболітів. Сорбційна делігандизація донорського САЛ проводиться за методом Chen R.F. [7] шляхом перфузії офіцінального розчину донорського САЛ через масобмінник, який містить 3 високоактивний вуглецевий гемосорбент ГСГД з наступними характеристиками: Vs - 0,098 см /г і 3 НВ - 2,5 г/см (Свідоцтво про державну реєстрацію №9267/2010 від 10.122010 p.). Оцінюється ступінь делігандизації білка шляхом вимірювання у розчині САЛ концентрації каприлату натрію, який вводиться до складу розчину донорського САЛ з метою запобігання термічній денатурації під час противірусної пастеризації. Зафіксована повна відсутність каприлату натрію у розчині донорського САЛ після делігандизації (делігандизований САЛ) свідчить про високий ступінь делігандизації. Процес альбумінізації ГСГД може бути проведений у 2 режимах. 3 3 Режим 1. Гемосорбент ГСГД з Vs - 1,50см /г, та НВ - 0,19 г/см поміщається у колонку 3 об'ємом 5 см . Альбумінізація сорбенту проводиться ex tempore у рециркуляційному режимі, а саме: розчин делігандизованого САЛ, що містить 50 мг білка в 1 мл, подається на вхід колонки зі швидкістю 0,625 мл/хв. Після появи білка на виході з колонки вхід і вихід замикаються між собою. Процес рециркуляції делігандизованого САЛ триває 60 хв, після закінчення визначається остаточна концентрація білка, що складає 30 мг/мл, та по різниці вихідної і остаточної концентрації визначається кількість іммобілізованого делігандизованого САЛ, що складає 789,5 мг/г. 3 3 Режим 2. Гемосорбент ГСГД з Vs - 1,50 см /г, та НВ - 0,19 г/см у кількості 950 мг інкубується у 190 мл розчину делігандизованого САЛ, що містить 30 мг білка в 1 мл, при температурі 4 °C протягом 24 год., після чого насичений альбуміном сорбент переноситься в колонку. В розчині делігандизованого САЛ визначається остаточна концентрація білка, що складає 26 мг/мл, та по різниці вихідної і остаточної концентрації визначається кількість іммобілізованого делігандизованого САЛ, що складає 795 мг/г. Порівняльний аналіз ефективності вилучення L-Tp та поглинання білка у процесі перфузїї модельного альбумінвмісного розчину через колонки з непокритим ГСГД (контроль) та ГСГД з іммобілізованим делігандизованим САЛ був проведений у наступній тест-системі: колонка 3 3 об'ємом 5 мл, заповнена ГСГД з Vs - 1,50см /г, та НВ - 0,19 г/см (контроль). Колонка об'ємом 5 мл, заповнена ГСГД іммобілізованим делігандизованим САЛ, перед тестуванням відмивається натрій-фосфатним буфером з рН 7,2 до нульової концентрації білка на виході з колонки. Альбумінвмісний натрій-фосфатний буферний розчин (рН 7,2) з концентрацією L-Tp 7,4 мг/мл і концентрацією білка 30 мг/мл перфузується через колонки зі швидкістю 0,625 мл/хв. протягом 4 год. Оцінюється ступінь поглинання L-Tp та білка після перфузії в пулі та на виході з колонок (у % від вихідної концентрації). Після 4-год. перфузії через колонки з ГСГД і ГСГД з іммобілізованим делігандизованим САЛ концентрація L-Tp знижувалась на 71,1 і 61,5 % відповідно. Концентрація L-Tp на виході з колонок становила 65,9 і 70,5 % від вихідної відповідно. Концентрація білка у розчині знижувалась на 12,7 і 2,4 % відповідно. Концентрація білка на виході з колонок становила 95,7 і 99,8 % від вихідної. Представлені дані свідчать, що покриття гемосорбенту ГСГД делігандизованим САЛ незначно впливає на ефективність видалення L-Tp, але помітно знижує поглинання білка у процесі перфузії. Приклад щодо практичного застосування корисної моделі Досліджена ефективність видалення L-Tp і поглинання білка з гепаринізованої крові онкологічних хворих у процесі гемокарбоперфузії in vitro через колонку об'ємом 5 мл, заповнену ГСГД з іммобілізованим делігандизованим САЛ, та проведена оцінка його гемосумісності. Вміст L-Tp знижувався після 2-годинної гемокарбоперфузії зі швидкістю 0,625 мл/хв. з 98 до 22 нмоль/мл, тобто на 79,6 %, тоді як вміст загального білка знижувався лише на 2,8 % (з 73 до 70,9 мг/мл). Кількість тромбоцитів та еритроцитів крові на вході і виході з колонки відрізнялась не більш ніж на 10,5 % (табл.2). 2 UA 69817 U Таблиця 2 Кількість формених елементів на вході і виході з колонки, яка заповнена ГСГД з іммобілізованим делігандизованим САЛ Показник Тромбоцити, 9 10 /л Еритроцити, 12 10 /л 5 10 15 20 25 30 На вході колонки 246,4±10,1 7,63±0,23 30 хв. 220,3±11,3 10,5 % 6,87±0,31 10,0 % На виході з колонки 60 хв. 227,2±10,0 7,8 % 7,15±0,27 6,3 % 120 хв. 225,4±11,2 8,5 % 7,0±0,29 8,3 % Таким чином, з представлених даних видно, що використання високоактивних гранульованих делігандизуючих гемосорбентів ГСГД, покритих делігандизованим сироватковим альбуміном людини, забезпечує в процесі гемокарбоперфузії ефективне вилучення з крові онкологічних хворих L-Tp і мінімальне поглинання білка на фоні високої сумісності сорбенту з кров'ю, що підтверджує дієвість способу, що заявляється. Джерела інформації: 1. Woolley P.V., Dion R., Bono V.H. Effect of tryptophan deprivation on L-1210 cells inculture // Cancer Res. - 1974. - Vol. 34. - P. 1010-1014. 2. Yoshida R., Park S.W., Takikawa O. Tryptophan degradation in transplanted tumor cells undergoing rejection // J. Immunol. - 1988. - Vol. 141, N 8. - P. 2819-2823. 3. Schroecksnadel K., Winkler C, Fuith L.C., Fuchs D. Tryptophan degradation in patients with gynecological cancer correlates with immune activation // Cancer Lett. - 2005. - Vol. 223, N 2. - P. 323-329. 4. Schmer G., Dennis M.B., Hsueh S., Hou K.C. The synthesis of L-tryptophan degrading bioreactors // Int. J. Artif. Organs. - 1990. - Vol. 13, N 5. - P. 316-320. 5. Ho D.H., Covington W.P., Wallerstein R.O. et al. // Depletion of patient's plasma tryptophan using tryptophan side-chain oxidase columns // Cancer Invest. - 1993. - Vol. 11, N 3. - P. 252-257. 6. Bambauer R., Giannitsis D., Schiel R., Latza R. Tryptophan depletion with hemoperfusion in cancer therapy // Artif. Organs. - 2001. - Vol. 25, N 10. - P. 785. 7. Chen R.F. Removal of fatty acids from serum albumin by charcoal treatment // J. Biol. Chem. 1967. - Vol. 242, N 2. - P. 173-181. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб видалення L-триптофану з крові хворих зі злоякісними новоутвореннями з використанням сорбенту, який відрізняється тим, що як сорбент використовуються гемосорбенти гранульовані делігандизуючі (ГСГД) з об'ємом сорбційних пор за бензолом не 3 3 нижче 1,5 см /г та насипною вагою не більше ніж 0,190 г/см , що покриваються сироватковим альбуміном людини, який перед іммобілізацією на ГСГД піддається сорбційній делігандизації. Комп’ютерна верстка А. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3