Штам lactobacillus plantarum, виділений із кишечнику медоносних бджіл apis mellifera l

Реферат: Штам Lactobacillus plantarum, виділений із кишечнику медоносних бджіл Apis mellifera L., для виготовлення біопрепаратів. UA 69926 U (12) UA 69926 U UA 69926 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнології та ветеринарної мікробіології і може бути використана для виготовлення біопрепаратів. Деякі мікроорганізми, а саме лактобацили, що надходять у кишечник бджіл з нектаром та пилком, можуть приєднуватись до механізму захисту личинок разом з факторами клітинного і гуморального імунітету. Використання з лікувально-профілактичною метою пробіотиків молочнокислих бактерій - є одним із перспективних напрямків рішення проблеми оздоровлення пасік. Із кишечнику медоносних бджіл Apis mellifera L. були ізольовані молочнокислі бактерії, такі як L. plantarum, L. casei, L. cellobiosus L. viridescens. В основу корисної моделі поставлено задачу виділити штам Lactobacillus plantarum з кишечнику медоносних бджіл Apis mellifera L. для виготовлення біопрепаратів. Штам мікроорганізму Lactobacillus plantarum виділено на пасіці ННЦ "ІЕКВМ" із кишечнику імаго бджіл від сім'ї, здорової у паразитарному та інфекційному відношенні. Штам зберігається у колекції музейних штамів лабораторії вивчення хвороб бджіл під № 230805, родина Lactobacillus, рід Lactobacillus, вид plantarum. Штам Lactobacillus plantarum характеризується наступними ознаками та властивостями. Культурально-морфологічні та біохімічні властивості. Lactobacillus plantarum - аеробні палички розміром (4-150,5-0,6) мкм, нерухомі, зустрічаються зігнуті і булавоподібні форми, також короткі кокобактерії. Нерухомі, спор і капсул не утворюють, за Грамом фарбуються позитивно. На середовищі МРС-4 культура Lactobacillus plantarum утворює округлі дрібні, розміром (2-5) мм, гладкі, блискучі колонії сіро-білого кольору зі сферичною поверхнею, тест на каталазу - негативний, желатин не змінює, цитохромоксидазу не утворює, нітрати не відновлює, індол та сірководень не утворює. Lactobacillus plantarum розщеплює вуглеводи: глюкозу, мальтозу, галактозу без утворення газу, не розщеплює сахарозу, лактозу, маніт, дульцит, ксилозу. Близько половини кінцевих вуглеводних метаболітів складає лактат. Бактерії вимогливі до складу поживних середовищ, тому як компоненти необхідно додавати амінокислоти, вітаміни, жирні кислоти, вуглеводи. Оптимальна температура росту (30-40)°С, оптимальна рН середовища (5,5-5,8). Утворюють кислоту в знежиреному молоці з кислотністю до 140° за Тернером. Антагоністичні властивості. Тест-культурами служили 5 штамів P. larvae і 1 штам М. pluton. Найбільшу активність дослідна культура проявляла відносно Р. larvae subsp. larvae - зона затримки росту становила від (15-20) мм, що залежало від індивідуальної чутливості тест-культур до продуктів життєдіяльності Lactobacillus plantarum, фізіологічного стану культур, концентрації мікроорганізмів, часу культивування. На рідкому поживному середовищі МРС-1 лактобацила проявляла менш виражений антагонізм, ніж на щільному (МРС-4). Результати антагоністичної активності штаму Lactobacillus plantarum наведені у таблиці 1. Дані таблиці вказують на високу антагоністичну активність виділеної лактобацили до збудників бактеріальних хвороб розплоду медоносних бджіл. Відношення до антибіотиків. Ріст бактерій інгібують пеніциліни, кліндаміцин і цефалотин. Нешкідливість культури. Для вивчення нешкідливості для бджіл формували 3 групи по 100 бджіл у кожній, яких утримували у садках. Бджолам двох дослідних садків згодовували цукровий сироп з дводобовою культурою Lactobacillus plantarum (змиву з середовища МРС-4, який містив 1 млрд. 3 3 3 м.к./см ) у дозі 1 см на 100 см сиропу, бджолам третього садка згодовували чистий цукровий сироп. Протягом наступних 7 діб визначали вплив лактобацили на комах. Через зазначений проміжок часу загибелі бджіл не зареєстрували. Результати проведених досліджень свідчать про нешкідливість культури Lactobacillus plantarum для медоносних бджіл Apis mellifera L. Адгезивні властивості лактобацил. Із однодобової культури лактобактерій, які вирощені на МРС-4, робили змив 0,9 % розчином натрію хлористого забуференим фосфатами з рН 7,2 (ЗФР) і готували суспензію мікробів з густиною, співвідносною 20 одиницям мутності. Еритроцити людини відмивали від консерванту 8 ЗФР трикратним центрифугуванням за (2-3 тис.об./хв.) і готували суспензію у концентрації 110 3 кл/мл. Після чого в пробірках змішували по 0,5 см суспензій лактобактерій та еритроцитів людини. Суміш інкубували на магнітній мішалці впродовж 30 хв. Далі готували мазки на предметних скельцях, фіксували їх метанолом та офарблювали за Романовським-Гімзе. 1 UA 69926 U 5 10 15 20 25 30 Мазки розглядали під світловим мікроскопом зі збільшенням 900. Величину цитадгезії (ЦА) оцінювали за середнім показником адгезії (СПА), що дорівнює середній кількості мікробів, що прикріпились до одного еритроциту за підрахунку на 50 еритроцитах. Даним дослідом був показаний вплив монокультури лактобацили на збудників in vitro. Були виявлені адгезивні властивості культур L. plantarum до еритроцитів людини (класичний метод виявлення цитадгезії), клітин гемолімфи (сферулоцитів) личинок медоносних бджіл, та взаємний вплив L. plantarum та Р. larvae на адгезію обох культур до клітин гемолімфи личинки бджіл (табл. 2). Встановлено, що виділена лактобацила є високоадгезивним штамом за визначеними показниками. Із даних таблиці 2 видно, що адгезія L. plantarum до еритроцитів людини склала у середньому 20 мікробних клітин на 1 еритроцит, що значно відрізняється від адгезії інших лактобацил (L. siccum-6 м.к./е, L. casei-12 м.к./е). Середній показник адгезії L. plantarum до клітин гемолімфи медоносних бджіл склав в середньому 21 м.к./сферулоцит. Основні умови зберігання. Зберігання та підтримання штаму проводять шляхом пересіву на середовище МРС-4 через кожні 30 діб. Приклад. Визначення летючих метаболітів Lactobacillus plantarum проводили таким чином: із однодобової дослідної культури лактобактерії готували суспензію за оптичним стандартом 3 мутності на 10 одиниць, засівали у першу чашку Петрі із середовищем МРС-4 у кількості 0,1 см та інкубували в термостаті за температури (37±1)°С упродовж 24 годин. В другу і третю чашку з молочно-жовтковим середовищем (Уілліса-Гобза) засівали тридобові культури P. larvae subs, larvae штрихами. Другу чашку накривали половинкою першої чашки з газоном однодобової дослідної культури; з'єднання чашок обмотували лейкопластиром. Реакцію тест-культур на дію летючих метаболітів дослідних культур оцінювали через (3-4) доби їх спільного росту. Третя чашка була контролем росту тест-культур, яка не зазнавала дії летючих метаболітів лактобацил. Вплив дослідної культури Lactobacillus plantarum на тест-мікроби P. larvae subs, larvae виявився пригнічуючим: спостерігали гальмування росту тест-культур, відсутність просвітлення середовища, у мазках гігантські розміри клітин, інтенсивне спороутворення. Стабільність властивостей штаму дозволяє використовувати його для виготовлення біологічних препаратів. Таблиця 1 Штам Lactobacillus plantarum, виділений із кишечнику медоносних бджіл Apis mellifera L. тест-культури Paenibacillus larvae 163 Paenibacillus larvae 168 Paenibacillus larvae 27.07 Paenibacillus larvae 12.08 Melisoccocus pluton 17.06 Paenibacillus alvei 21.2.09 зона затримки росту, мм 20 18 15 16 14 13 Таблиця 2 Штам Lactobacillus plantarurn, виділений із кишечнику медоносних бджіл Apis mellifera L. Показник СПА до еритроцитів КА ІАМ СПА до сферулоцитів КА ІАМ P. larvae 3,36 0,87 2,92 Цитадгезія мікроорганізмів, м.к./ клітина L. plantarum L. siccum 20 6 0,9 18 21 0,9 20,16 2 L. casei 12 UA 69926 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Штам Lactobacillus plantarum, виділений із кишечнику медоносних бджіл Apis mellifera L., для виготовлення біопрепаратів. Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3