Штам enterococcus durans 43-д для використання в тест-системах для видової ідентифікації ентерококів за біохімічними ознаками

Реферат: Штам Enterococcus durans для використання як негативного контролю в тест-системах для видової ідентифікації ентерококів за біохімічними ознаками, депонований в депозитарії ДУ "Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л. В. Громашевського АМН України" за № 43-Д. UA 70576 U (12) UA 70576 U UA 70576 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до мікробіології та лабораторної діагностики, зокрема являє собою штам Enterococcus durans, що може використовуватися в тест-системах для біохімічної ідентифікації клінічно значущих представників роду Enterococcus. Штам придатний для використання як негативного контролю при урахуванні результатів дослідження, а також як контрольної референтної культури при оцінці функціональності окремих партій тест-систем типу EN-COCCUStest (виробник Pliva-Lachema Diagnostika, Чехія), доступних на вітчизняному ринку. Використання тест-систем для ідентифікації клінічних ізолятів мікроорганізмів дозволяє суттєво скоротити обсяг робіт та витратних матеріалів, необхідних для проведення дослідження, у порівнянні з рутинними методами бактеріологічної діагностики. EN-COCCUStest дозволяє оцінити профіль біохімічної активності мікроорганізмів по відношенню до восьми субстратів (аргінін, сорбоза, арабіноза, манітол, сорбітол, мелібіоза, рафіноза і мелецитоза), розташованих у 8-лункових стрипах 96-лункової пластинки, розрахованої на одночасну ідентифікацію 12 штамів. Оцінка результатів тесту здійснюється візуально: за таблицею "Інтерпретація результатів" з використанням кольорової шкали та/або кольорових реакцій контрольних штамів. При цьому використання контрольних штамів дозволяє, певним чином, підвищити об'єктивність оцінки та контролювати функціональність тест-системи. Як негативний контроль в EN-COCCUStest виробником рекомендується референтний штам T Enterococcus durans ССМ 5612 [Collins, M.D. Enterococcus avium nom. rev., comb, nov.; E. casseliflavus nom. rev., comb, nov.; E. durans nom. rev., comb, nov.; E. gallinarum comb, nov.; and E. malodoratus sp. nov. [Text]/ Collins, M. D., Jones, D., Farrow, J.A.E., Kilpper-Balz, R., Schleifer, K.H. Int. Hi. Syst. Bacteriol. - 1984. - V. 34. - P. 220-223], що є прототипом корисної моделі, яка заявляється. Він характеризується широким спектром біохімічної активності, але дає негативну реакцію з більшістю субстратів тест-системи (за винятком аргініну). В склад набора ENCOCCUStest, доступного на вітчизняному ринку, цей штам не входить, оскільки експортноімпортні операції з біологічним матеріалом вимагають дотримання складних та вартісних процедур. Штам депоновано в багатьох національних та міжнародних колекціях (ССМ T 5612 =АТСС 19432=ССТМ La 2365=СІР 55.125 - CNCTC Str 8/63=DSM 20633=JCM 8725=LMG 10746=NCDO 596=NCTC 8307), однак в Україні не депоновано. Складність та вартість процедури трансферу, поряд з необхідністю періодичного оновлення культури, робить його придбання для окремої клініко-діагностичної лабораторії в Україні економічно недоцільним, що ускладнює використання тест-системи. Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості Enterococcus durans ССМ T 5612 . Факультативно анаеробні, каталазо-негативні Грам-позитивні коки розміром (0,6×0,6-1,5) мкм, в мазках розташовуються окремо, парами або ланцюжками. Спор та капсул не утворюють, нерухомі. При вирощуванні на поверхні середовища «Ентерококагар» колонії світло-рожевого кольору, правильної округлої форми діаметром 0,7-1,0 мм, з гладкою, випуклою поверхнею та рівним краєм. В рідких поживних середовищах утворюють однорідну каламуть. Здатний рости при температурі (10-45) °С, температурний оптимум - 37 °С. Оптимальне для росту значення рН - рН 6,3-6,6. Росте при 40 % жовчі, при 6,5 % NaCl, при рН 9,6. Гідролізує аргінін, ескулін. Ферментує вуглеводи з утворенням молочної кислоти без продукування вуглекислого газу. Зброджує D-глюкозу, галактозу, лактозу, мальтозу, D-манозу, рибозу, трегалозу, саліцин. Не ферментує арабінозу, D-арабітол, L-арабітол, гліцерол, манітол, мелібіозу, мелецитозу, рафінозу, сорбітом, сорбозу, інулін, сахарозу, рамнозу, ксілозу. Дані T табл. 1 ілюструють біохімічні властивості Enterococcus durans CCM5612 . Таблиця 1 T Біохімічні властивості Enterococcus durans CCM 5612 за результатами дослідження з використанням EN-COCCUStest (температурний оптимум +37 °С) Тести Н ARG + 50 G SOE F ARA Е MAN D OR С MLB В RAF А MLZ Примітки: ARG - аргінін, SOE - сорбоза, ARA - арабіноза, MAN - манітол, SOR - сорбітол, MLB - мелібіоза, RAF - рафіноза, MLZ - мелецитоза, "+" - позитивний результат, "-" - негативний результат. 1 UA 70576 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В основу корисної моделі поставлено задачу ізолювати, охарактеризувати та депонувати в Україні новий штам Е. durans, що, за спектром біохімічної активності є придатним для використання як референтного в тест-системах для ідентифікації представників роду Enterococcus. Поставлену задачу вирішено використанням штаму, ізольованого у 2007 році в бактеріологічній лабораторії Міської лікарні № 2 м. Харкова з кишечника хворого на цукровий діабет. Штам ідентифіковано як Е. durans, в філії Музею мікроорганізмів на базі ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України», м. Харків, вул. Пушкінська, 14/16. Спосіб одержання штаму. Штам культивовано в поживному середовищі «Ентерококагар» (Росія) шляхом пересівів з окремих колоній 1-2 рази на тиждень з подальшою витримкою в термостаті при 37±0,5 °С. Кінцеве клонування штаму проведено двадцятьма пасажами з окремих колоній. В процесі виконаних пасажів ретельно вивчено біохімічні властивості проміжних культур ентерококу і підтверджено їх стабільність протягом року. Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості штаму. Морфологія. Грампозитивні коки розміром (0,6×0,6-1,5) мкм в мазках розташовуються окремо, парами або ланцюжками. Спор та капсул не утворюють, нерухомі. Культуральні властивості. Штам Enterococcus durans 43-Д за типом дихання - факультативний анаероб. При вирощуванні на поверхні середовища «Ентерококагар» колонії світло-рожевого кольору мають правильну округлу форму діаметром 0,7-1,0 мм, гладку, випуклу поверхню, рівний край. У бульйоні утворюють однорідну каламуть. Фізіолого-біохімічні властивості. Каталазонегативний. Росте при температурі (10-45) °С, температурний оптимум - 37 °С. Оптимальне для росту значення рН - рН 6,3-6,6. Росте при 40 % жовчі, при 6,5 % NaCl, при рН 9,6. Гідролізує аргінін, ескулін. Ферментує вуглеводи з утворенням молочної кислоти без продукування вуглекислого газу. Зброджує D-глюкозу, галактозу, лактозу, мальтозу, D-манозу, рибозу, трегалозу, саліцин. Не ферментує арабінозу, D-арабітол, L-арабітол, гліцерол, манітол, мелібіозу, мелецитозу, рафінозу, сорбітом, сорбозу, інулін, сахарозу, рамнозу, ксілозу. Умови зберігання. Для довгострокового та більш надійного зберігання штаму необхідна його ліофілізація, що може бути виконано за стандартною технологією. Тимчасове зберігання штаму ентерококу до місяця включно можливо проводити у пробірках з середовищем МПА під шаром вазелінової олії в рефрижераторі з температурою у діапазоні від +2 до +5 °С. Спосіб, умови та склад середовища для культивування штаму. Для одержання культури з ліофілізованого матеріалу здійснюють регідратацію шляхом додавання 5 мл фізіологічного розчину хлориду натрію або поживного середовища. Після цього матеріал серійно розводять по 1 мл в рядах з 9 пробірками по 9 мл середовища в кожній і витримують в термостаті з щоденною перевіркою протягом 4 днів. Відомості про депонування: штам Enterococcus durans депоновано у Депозитарії ДУ "Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л. В. Громашевського АМН України" за номером 43-Д 22 березня 2010 року. Можливість здійснення корисної моделі підтверджує нижче наведений приклад використання штаму, що заявляється. Приклад. Визначення якості тест-системи EN-COCCUStest виробництва Pliva-Lachema Diagnostika (Чехія): контроль функціональності набору та якості проведення видової ідентифікації ентерококів з використанням штаму Enterococcus durans 43-Д як негативного контролю. Чисті культури контрольних штамів виду Enterococcus durans 43-Д висівають на кров'яний агар для отримання ізольованих колоній та інкубують при 37 °С протягом 18-24 годин. Подальша послідовність технологічних дій проводиться згідно з інструкцією по використанню набору EN-COCCUStest виробництва Рlіvа-Lachema Diagnostika (Чехія). Приготування суспензій мікроорганізмів із визначеною концентрацією мікробних клітин проводили за допомогою електронного приладу Densi-La-Meter (PLIVA-Lachema a.s., Чехія) за шкалою McFarland згідно з інструкцією. З поверхні агарових середовищ стерильним фізіологічним розчином змивають культуру та доводять до двох одиниць оптичного стандарту щільності за McFarland. Водночас здійснюють 2 UA 70576 U 5 10 посів суспензії культури для перевірки її чистоти та ростових властивостей. Інкубують при температурі 37 °С протягом 24 годин. Суспензію ретельно струшують та вносять по 0,1 мл в лунки одного ряду пластинки. Після інокуляції в лунки колонки Н (тест на аргінін) додають 2 краплі парафінового масла. Закривають пластинку, розміщують в поліетиленовому пакеті, інкубують при температурі (35-37) °С протягом 24 годин, після чого здійснюють оцінку результатів тестів. Тест-система може вважатися придатною до використання, якщо профіль біохімічної активності референтного штаму Enterococcus durans 43-Д відповідає стандарту, а саме аргінін позитивний тест (червоно-фіолетовий або червоний колір), сорбоза, арабіноза, манітол, сорбітол, мелібіоза, рафіноза, мелецитоза - негативний тест (червоний або помаранчевочервоний колір). Отримані дані наведено в табл. 2. Таблиця 2 Біохімічні властивості Enterococcus durans 43-Д за результатами дослідження з використанням EN-COCCUStest (температурний оптимум +37 °С) Тести Н ARG + 15 20 G SOE F ARA Е MAN D SOR С MLB В RAF А MLZ Примітки: ARG - аргінін, SOE - сорбоза, ARA - арабіноза, MAN - манітол, SOR - сорбітол, MLB - мелібіоза, RAF - рафіноза, MLZ - мелецитоза, "+" - позитивний результат, "-" - негативний результат. Наведені результати підтверджують можливість здійснення корисної моделі, оскільки за параметрами, які оцінюються в тест-системі EN-COCCUStest, штам Enterococcus durans 43-Д T ідентичний штаму Enterococcus durans ССМ 5612 . ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Штам Enterococcus durans для використання як негативного контролю в тест-системах для видової ідентифікації ентерококів за біохімічними ознаками, депонований в депозитарії ДУ "Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л. В. Громашевського АМН України" за № 43-Д. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3