Спосіб визначення активності g-глютамілтранспептидази в паренхімі нирки в експерименті

Реферат: Спосіб визначення активності -глютамілтранспептидази в паренхімі нирки в експерименті включає вимірювання пара-нітроаніліну, утвореного в ході переносу ферментом L-глютамілового залишку з L--глютаміл-пара-нітроаніліну на дипептидний акцептор гліцил-гліцин та за кількістю звільненого за одиницю часу пара-нітроаніліну визначають активність глютамілтранспептидази. Вимірювання проводять в 25 %-му розчині гомогенату паренхіми нирки, додатково розведеному фізіологічним розчином в 101 раз до екстинкції, максимально допустимої калібрувальним графіком. UA 71210 U (12) UA 71210 U UA 71210 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спосіб належить до медицини, а саме до урології, нефрології та клінічної біохімії, і може бути використаним для оцінки особливостей метаболічних процесів, які можуть бути змодельовані в експерименті в паренхімі нирки. В основі лікування багатьох патологічних станів нирки лежать ішемічні процеси. Порушення внутрішньониркової гемодинаміки, наслідком якої є гіпоксія, призводить до цілого каскаду патологічних процесів, зокрема до дисметаболізму, спричиненому дистрофічно-деструктивними змінами клітинних елементів ниркової паренхіми, що в результаті веде до розвитку ниркової недостатності, тому постає задача конкретизувати, які саме порушення відбуваються при ішемії в паренхімі нирки і, зокрема, в її функціональній одиниці - нефроні. Чутливими маркерами ушкодження нефротелію є ферменти, і вивчення їх активності дає змогу оцінити ступінь ураження паренхіми нирки. Одним з ферментів, що має високу активність в нирковій тканині, є глютамілтранспептидаза (КФ 2.3.2.2), що пов'язана з плазматичною мембраною клітин щіткової облямівки звивистих канальців, при цьому її активність в нирках в 7000 разів вища за активність в сироватці крові. Відомий уніфікований метод визначення активності -глютамілтранспептидази в сироватці крові [1], що взятий за прототип, який базується на вимірюванні пара-нітроаніліну, утвореного в ході переносу ферментом L--глютамілового залишку з L-y-глютаміл-пара-нітроаніліну на дипептидний акцептор гліцил-гліцин та за кількістю звільненого за одиницю часу паранітроаніліну судять про активність -глютамілтранспептидази в сироватці крові, при чому, якщо активність ферменту вище 5000 нмоль/сек.л, що за калібрувальним графіком відповідає екстинкції 0,382, пробу розводять фізіологічним розчином. Недоліком способу є те, що визначення активності -глютамілтранспептидази проводять в сироватці крові. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб визначення активності глютамілтранспептидази в паренхімі нирки в експерименті шляхом вимірювання паранітроаніліну, утвореного в ході переносу ферментом L--глютамілового залишку з L--глютамілпара-нітроаніліну на дипептидний акцептор гліцил-гліцин та за кількістю звільненого за одиницю часу пара-нітроаніліну визначають активність -глютамілтранспептидази в гомогенаті паренхіми нирки розведеного фізіологічним розчином; оскільки гомогенат суттєво відрізняється від сироватки крові за фізико-хімічними властивостями, а саме прозорістю, оптичною густиною і надто високою активністю цього ензиму в нирковій тканині, готують 25 %-ий розчин гомогенату паренхіми нирки, який розводять в подальшому до максимально допустимої калібрувальним графіком екстинкції в 101 раз, що дасть можливість оцінити особливості метаболічних процесів різних патологічних станів, які можуть бути змодельовані в паренхімі нирки в експерименті. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб визначення активності глютамілтранспептидази в паренхімі нирки в експерименті, який включає вимірювання паранітроаніліну, утвореного в ході переносу ферментом L--глютамілового залишку з L--глютамілпара-нітроаніліну на дипептидний акцептор гліцил-гліцин та за кількістю звільненого за одиницю часу пара-нітроаніліну визначають активність -глютамілтранспептидази, згідно з корисної моделлю, вимірювання проводять в 25 %-му розчині гомогенату паренхіми нирки, додатково розведеному фізіологічним розчином в 101 раз до екстинкції, максимально допустимої калібрувальним графіком. Запропонований спосіб виконують наступним чином: в експерименті у кроля вилучають дослідну нирку, з паренхіми якої готують 25 % розчин гомогенату в розведенні 1:3, для чого тканину паренхіми нирки ретельно розтирають на холоду в скляному гомогенізаторі і до 1 г розтертої ниркової тканини додають 3,0 мл фізіологічного розчину, одержаний в такий спосіб 25 %-ний розчин гомогенату центрифугують 15 хвилин при 1500 об/хв., з надосадової рідини готують робочий розчин розведенням в 101 раз 25 %-ного гомогенату (до 2,0 мл фізіологічного розчину додають 0,02 мл надосадової рідини). Цілковита прозорість і безбарвність розведеного гомогенату дозволяє уникнути отримання хибно підвищених результатів, які виникають внаслідок надмірної каламутності або забарвлення досліджуваного біологічного середовища. Надалі в пробірку з 0,5 мл стандартного субстратно-буферного розчину додають 0,05 мл робочого розчину гомогенату, перемішують і інкубують 15 хвилин при 37 °C. Після інкубації ферментативну реакцію припиняють додаванням 3 мл 10 % оцтової кислоти. Контрольну пробу ставлять так само, як і дослідну, але біоматеріал додають після інкубації. Вимірюють екстинкцію дослідної проби проти контрольної при довжині хвилі 400-430 нм в кюветі з довжиною оптичного шляху 1 см. Визначення активності -глютамілтранспептидази в гомогенаті проводять за калібрувальним графіком, для побудови якого зі стандартного розчину пара-нітроаніліну готують розведення відповідно з інструкцією до стандартного набору. При розрахунку 1 UA 71210 U 5 10 15 активності -глютамілтранспептидази в паренхімі нирки враховують розведення гомогенату в 101 раз і концентрацію самого гомогенату (25 %). Активність -глютаміл-транспептидази в гомогенаті визначають за кількістю звільненого за одиницю часу пара-нітроаніліну та вимірюють в мкмоль/секл (мккат/л), активність ферменту в паренхімі нирки розраховують на 1 г сирої тканини та виражають в нмоль/сек.г тканини (нкат/г тканини). Апробацію способу, що заявляється, проведено в лабораторіях біохімії та нейроурології ДУ "Інститут урології НАМН України". Дослідження проведені на 35 експериментальних тваринах кролях, статевозрілих самцях вагою у середньому 3,2±0,05 кг. Для визначення оптимального ступеня розведення 25 %-ого гомогенату визначення проводили в: в нерозведеному 25 %-ому гомогенаті; в розведеному в 5 разів (05 мл 25 % гомогенату + 2,0 мл фізіологічного розчину, тобто у співвідношенні 1:4); в розведеному в 20 разів (0,1 мл 25 % гомогенату + 1,9 мл фізіологічного розчину, тобто у співвідношенні 1:19); в розведеному в 51 раз (0,02 мл 25 % гомогенату + 1,0 мл фізіологічного розчину, тобто у співвідношенні 1:50); в розведеному в 101 раз (0,02 мл 25 % гомогенату + 2,0 мл фізіологічного розчину, тобто у співвідношенні 1:100). Отримані результати визначення активності -глютамілтранспептидази в гомогенаті паренхіми нирки кроля № 1 (протокол від 18.01.2008) наводимо в таблиці. Таблиця Залежність визначеної активності -глютамілтранспептидази в гомогенаті паренхіми нирки кроля від ступеня розведення гомогенату Показники 25 % гомогенат 5 раз 0,708* 25 % гомогенат, розведений в 20 раз 51 раз 0,580* 0,376 Екстинкція 0,685* Активність ферменту в пробі без урахування 8966,0** 9267,0** 7591,6** розведення (в нмоль/сек.л) Активність ферменту з урахуванням 9,0 46,3 151,8 розведення (в мкмоль/сек.л) * - величина екстинкції перевищує максимально допустимий рівень; ** - активність ферменту перевищує максимально допустиму. 20 25 30 35 40 101 раз 0,220 4767,7 2444,4 243,0 247,1 Як свідчать представлені в таблиці результати, використання нерозведеного 25 %-ого гомогенату та розведення його в 5 та 20 разів дають хибно занижені показники активності глютамілтранспептидази в гомогенаті паренхіми нирки, що пояснюється надто інтенсивним забарвленням проби і, відповідно, дуже високою екстинкцією. Вимога розводити біопроби з активністю вище за 5000 нмоль/сек.л продиктована невідповідністю кількості субстрату в пробірці надто високій активності -глютамілтранспептидази в пробі. Розведення в 51 та 101 разів в кінцевому перерахунку дають практично однакові результати, проте в пробі, розведеної в 51 раз, екстинкція та активність ферменту без урахування розведення знаходяться на межі максимально допустимого калібрувальним графіком рівня. Таким чином, розведення 25 %-ного гомогенату в 101 раз є самим оптимальним для визначення активності -глютамілтранспептидази в гомогенаті паренхіми нирки кроля. Наводимо приклад застосування запропонованого способу. Приклад. Із тканини коркового шару нирки кроля № 47 (протокол від 19.10.10 p.), згідно із запропонованим способом, готують 25 %-ний гомогенат, надосадову рідину розводять в 101 раз (до 2 мл фізіологічного розчину додають 0,02 мл надосадової рідини 25 % гомогенату), визначають активність -глютамілтранспептидази, яка становить 1811,11 нмоль/сек.л. В вихідному 25 %-ному гомогенаті активність ферменту буде в 101 раз вище, відповідно 182,92 мкмоль/сек.л. Для обчислення активності ферменту в 1 грамі тканини паренхіми нирки враховують 25 % концентрацію гомогенату: в 100 г гомогенату міститься 25 г ниркової тканини, що відповідає концентрації 250 г/л. В перерахунку на 1 г ниркової тканини активність глютамілтранспептидази буде в 250 разів менше, ніж 182,92 мкмоль/сек.л, тобто 731,68 нм/сг ниркової тканини (нкат/г ниркової тканини). 2 UA 71210 U 5 Таким чином, спосіб визначення активності -глютамілтранспептидази в паренхімі нирки є інформативним, нескладним у виконанні, добре відтворюваним (коефіцієнт варіабельності способу не перевищує ± 5,7 %) і потребує невеликої кількості біологічного матеріалу. Джерела інформації: 1. Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике [Текст]. Т. 1: справочник / B.C. Камышников.-2-е изд. - Мн.: Беларусь, 2002. - 463 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Спосіб визначення активності -глютамілтранспептидази в паренхімі нирки в експерименті, який включає вимірювання пара-нітроаніліну, утвореного в ході переносу ферментом L-глютамілового залишку з L--глютаміл-пара-нітроаніліну на дипептидний акцептор гліцил-гліцин та за кількістю звільненого за одиницю часу пара-нітроаніліну визначають активність глютамілтранспептидази, який відрізняється тим, що вимірювання проводять в 25 %-му розчині гомогенату паренхіми нирки, додатково розведеному фізіологічним розчином в 101 раз до екстинкції, максимально допустимої калібрувальним графіком. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3