Спосіб комплексної оцінки апоптозу ендокриноцитів панкреатичних острівців

Реферат: Спосіб комплексної оцінки апоптозу ендокриноцитів панкреатичних острівців шляхом проведення імуноморфологічного дослідження, виявлення р53- і Bcl-2-імунопозитивних клітин та розрахування відсоткової частини р53- і Bсl-2-імунопозитивних клітин. На паралельних серійних зрізах гістологічного матеріалу підшлункової залози виявляють кількість бетаендокриноцитів. Визначають відсоток р53- та Bcl-2-імунопозитивних клітин серед інсулінпозитивних ендокриноцитів, розраховують індекс апоптозу (ІА) за формулою: ІА=(Np53/Nins x 100 %) / (NBcl/Nins x 100 %) і, якщо індекс апоптозу є більше 2, вважають, що апоптотичні процеси активуються, а при зниженні менше 2 - що вони затухають. UA 71303 U (54) СПОСІБ КОМПЛЕКСНОЇ ОЦІНКИ АПОПТОЗУ ЕНДОКРИНОЦИТІВ ПАНКРЕАТИЧНИХ ОСТРІВЦІВ UA 71303 U UA 71303 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель стосується медицини, а саме нормальної і патологічної фізіології, патологічної анатомії та біохімії, і може бути застосована в клінічній лабораторній діагностиці біоптатів підшлункової залози. Проблема комплексної оцінки апоптозу ендокриноцитів панкреатичних острівців є актуальною для експериментальної та клінічної медицини. Комплексна оцінка апоптозу ендокриноцитів підшлункової залози необхідна не тільки для діагностики таких важких захворювань, як цукровий діабет 1 та 2 типів, інсулінома, метаболічний Х-синдром, але і для визначення ступеня тяжкості захворювання, методу лікування та прогнозування перебігу хвороби. На жаль, на цей час немає достатньо ефективного, доступного, інформативного та універсального методу комплексної оцінки апоптозу ендокриноцитів підшлункової залози. Тому розробка нової методики оцінки апоптозу ендокриноцитів підшлункової залози є актуальним питанням сучасної медицини і викликає необхідність приділити увагу розробці такого способу. Найбільш близьким за технічною суттю та результатами, що досягаються, є спосіб, який полягає у визначенні ступеня експресії про- (р53) та антиапоптотичних (Bсl-2) протеїнів в тканинах [Капланов К.Д., Писарев В.Б., Корнева Е.П., Орлов В.А., Гайворонская И.В., Гемджян Э.Г., Воробьев И.А. Экспрессия белков р53 и Bсl-2 при лимфогранулематозе, как предиктор эффективности химиотерапии первой линии // Успехи современного естествознания.-2004. № 3 - С. 71-72]. Для цього проводять імуноморфологічне дослідження експресії протеїнів р53 та Bсl-2 діагностичними клітинами при лімфогранулематозі в групах хворих із різною відповіддю на схеми хіміотерапії першої лінії. Прототип та спосіб, що пропонується, мають такі спільні суттєві ознаки: - застосування імуноморфологічного методу; - визначення р53-імунопозитивних клітин; - визначення Bсl-2-імунопозитивних клітин; - розрахування відсоткової частини р53- та Bсl-2-імунопозитивних клітин. Але спосіб-прототип є недостатньо ефективним, тому що відсутня специфічна ідентифікація клітин, в яких визначають маркери р53 та Bсl-2, розраховується не коефіцієнт, а тільки відсоток р53- та Bсl-2-імунопозитивних клітин. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу комплексної оцінки апоптозу ендокриноцитів панкреатичних острівців шляхом розрахування індексу апоптозу (ІА) серед специфічно ідентифікованих бета-клітин підшлункової залози за відсотковою чисельністю серед них р53 та Bсl-2-імунопозитивних клітин, що забезпечить підвищення чутливості, якості визначення апоптозу, розширення діапазону досліджуваних об'єктів та кількісної оцінки ІА на одиницю площі гістологічного матеріалу. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає імуноморфологічне дослідження р53 й Bсl-2-імунопозитивних клітин та розрахування відсоткової частини р53- і Bсl2-імунопозитивних клітин, новим є те, що на паралельних серійних зрізах гістологічного матеріалу підшлункової залози виявляють кількість бета-ендокриноцитів, визначають відсоток р53- та Bсl-2-імунопозитивних клітин серед інсулін-позитивних ендокриноцитів й розраховують індекс апоптозу (ІА) за формулою: ІА=(Np53/Nins100 %) / (NBcl/Nins100 %), де Np53 - чисельність р53-імунореактивних ендокриноцитів; NBcl-2 - чисельність Bcl-2-імунореактивних ендокриноцитів; Nins - чисельність інсулін-імунопозитивних ендокриноцитів. В нормі у експериментальних тварин ІА становить 2, при його підвищенні більше 2 слід казати про перевагу апоптотичних процесів, а при зниженні менше 2 - про затухання процесу апоптозу. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у такому: - паралельна специфічна ідентифікація інсулін синтезуючих клітин в гістологічних зрізах підшлункової залози дозволяє чітко ідентифікувати р53 та Bсl-2-імунопозитивні клітини; - розрахування ІА здійснюється на одиницю площі тканини та кількість бета-клітин панкреатичних острівців; - виключається врахування не ендокринних клітин, які теж можуть експресирувати протеїни р53 та Bсl-2; - ІА визначається тільки в клітинах, які двічі імунопозитивні, а саме інсулін-р52 та інсулін-Bсl2; - розрахування ІА дозволяє отримати цілісну оцінку репаративних процесів в підшлунковій залозі при запалювальній або аутоімунній деструкції. Спосіб здійснюють таким чином: Негайно після одномоментної декапітації тварин під наркозом (етамінал натрію 40 мг/кг внутрішньочеревинно) підшлункову залозу витягали й розміщували у фіксатор Буену на 20 год. при кімнатній температурі. 1 UA 71303 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Після 2-годиного відмивання пікринової кислоти в проточній холодній воді підшлункову залозу проводили у висхідних концентраціях етанолу від 50 % до 100 %, розчинах етанол/ксилол, ксилол, ксилол/ парапласт (MkCormick, США) (Т=+37 °C), на 1 год. поміщали в рідкий парапласт (MkCormick, США) (Т=+56 °C) і потім розміщували в парапластові блоки. Для гістологічного дослідження з біологічного матеріалу підшлункової залози на ротаційному мікротомі MICROM HR-325 (Microm, Німеччина) виготовляли серійні 5 мкм зрізи. Після 10-денної інкубації зрізів у термостаті при (Т=+37 °C) їх депарафінували в ксилолі, проводили регідратацію в спадних концентраціях етанолу (96 %, 90 %, 70 %, 50 %) і тричі по 10 хв відмивали в 0,1 М фосфатному буфері (р 7.2). Регідровані зрізи підшлункової залози інкубували із первинними мишачими антитілами Monoclonal Anti Bсl-2, (SIGMA, USA) (для визначення антиапоптотичної активності) та Anti-Rabbit IgG (SIGMA, USA) для визначення проапоптотичної активності Anti p53 rabbit polyclonal IgG (Santa Cruz Biotechnology, USA) в розведенні 1:1000 в 0,1 M фосфатному буфері (рН 7.2) протягом 15 годин при Т=+4 °C. Після дворазового по 10 хв відмивання надлишку первинних антитіл в 0,1 М у фосфатному буфері, зрізи для виявлення р53- та Bсl-2-позитивних клітин інкубували 60 хв (Т=+37 °C) із вторинними мишачими антитілами - Anti-Mouse Ig (SIGMA, USA), у розведенні 1:64 в 0,1 М фосфатному буфері (рН 7.2), а зрізи для виявлення інсулінпозитивних клітин - інкубували 60 хвилин (Т=+37 °C) із вторинними козячими антитілами, кон'югованими із FITC (Peninsula Laboratories Inc., USA), у розведенні 1:100 в 0,1 М фосфатному буфері (рН 7.2). По закінченню інкубації зрізи промивали 0,1 М фосфатним буфером два рази по 10 хв і розміщували в суміш гліцерину й фосфатного буфера (9:1) для наступної флуоресцентної мікроскопії. Зображення, одержуване на мікроскопі AXIOSKOP (Zeiss, Німеччина) із широкоапертурним x об'єктивом AxioFluar 40 /1.30 (Zeiss, Німеччина) за допомогою високоемісійного світлофільтра 38НЕ (Zeiss, Німеччина) через високочутливу відеокамеру COHU 4922 (COHU Inc., США) вводилося в комп'ютерну систему цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина). При цьому виключався ефект "вигоряння" препарату під впливом ультрафіолетового опромінення. Вводили й враховували тільки ті ділянки підшлункової залози, які містили острівці, не дивлячись на наявність або відсутність флуоресціюючих клітин. На серійних зрізах підшлункової залози підраховували кількість р-53, Bсl-2-позитивних клітин та інсулінпозитивних ендокриноцитів. Надалі обчислювали індекс апопотозу (ІА) ендокриноцитів підшлункової залози за формулою: ІА=(Np53/Nins100 %) / (NBcl/Nins100 %), де Np53- чисельність р53-імунореактивних ендокриноцитів; NBcl-2 - чисельність Bсl-2-імунореактивних ендокриноцитів; Nins - чисельність інсулін-імунопозитивних ендокриноцитів. Якщо індекс апопотозу (ІА) був вищим за 2, то вважали, що переважають процеси апоптозу, а при зниженні менше 2 - що вони затухають. Приклад Для визначення індексу апоптозу при експериментальному цукровому діабеті щурам самцям лінії Вістар в кількості 15 тварин одноразово, внутрішньочеревинно вводили стрептозотоцин в дозі 45 мг/кг ваги тварини розведеного ex tempore в 1 мл 0,1 М цитратного буферу рН 4,5. На 28 день протікання патологічного процесу тварин декапітували під етаміналовим наркозом та проводили виділення біологічного матеріалу підшлункової залози за віщеозначеною методикою. Результати експерименту приведено у таблиці. Таблиця Експериментальна група контроль експериментальний цукровий діабет 50 Nins чисельність інсулінімунопозитивних ендокриноцитів 52±4 NBcI-2 Чисельність Bсl-2імунореактивних ендокриноцитів 6+1 Np53 Чисельність р53імунореактивних ендокриноцитів 12±2 Індекс апоптозу ІА 12±1 1+0,1 3±0,5 4,5 2 Як показано в таблиці, розвиток аутоімунної деструкції при цукровому діабеті призводить не тільки до зниження кількості інсуліноцитів внаслідок їх загибелі, спостерігається зниження 2 UA 71303 U проліферативної активності та активація апоптозу ендокриноцитів із суттєвим збільшенням індексу апоптозу (ІА) більше 4. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 Спосіб комплексної оцінки апоптозу ендокриноцитів панкреатичних острівців шляхом проведення імуноморфологічного дослідження, виявлення р53- і Bcl-2-імунопозитивних клітин та розрахування відсоткової частини р53- і Bсl-2-імунопозитивних клітин, який відрізняється тим, що на паралельних серійних зрізах гістологічного матеріалу підшлункової залози виявляють кількість бета-ендокриноцитів, визначають відсоток р53- та Bcl-2-імунопозитивних клітин серед інсулінпозитивних ендокриноцитів, розраховують індекс апоптозу (ІА) за формулою: ІА=(Np53/Nins x 100 %) / (NBcl/Nins x 100 %), де Np53 - чисельність p53-імунореактивних ендокриноцитів; NBcl-2 - чисельність Bсl-2-імунореактивних ендокриноцитів; Nins - чисельність інсулін-імунопозитивних ендокриноцитів, і, якщо індекс апоптозу є більше 2, вважають, що апоптотичні процеси активуються, а при зниженні менше 2 - що вони затухають. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3