Спосіб модуляції внутрішньоклітинної експресії ядерного фактору kb

Реферат: Спосіб модуляції внутрішньоклітинної експресії ядерного фактору kВ включає застосування фармацевтичних засобів для модуляції NF-kB. Як фармацевтичний засіб використовується агоніст ΠΠΑΡ-γ рецепторів піоглітазон. UA 72146 U (54) СПОСІБ МОДУЛЯЦІЇ ВНУТРІШНЬОКЛІТИННОЇ ЕКСПРЕСІЇ ЯДЕРНОГО ФАКТОРУ kB UA 72146 U UA 72146 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузей біології та медицини та може бути використана при патологіях, що супроводжуються порушенням NF-kB-сигнального шляху. Відомо, що родина транскрипційних факторів NF-kB бере участь в регуляції відповіді клітин на несприятливі зовнішні впливи, пошкодження, а також - запальних процесів і імунних реакцій. Активація NF-kB контролює експресію багатьох генів, які кодують продукцію цитокінів, хемокінів, рецепторів імунокомпетентних клітин, молекул клітинної адгезії, факторів росту та реактантів гострої фази. Тому прямо або опосередковано NF-kB контролює біологічно важливі функції клітин, в тому числі процеси вродженої та набутої імунної відповіді. Серед чисельних регуляторів каскадів, пов'язаних з NF-kB, чільне місце посідають ядерні рецептори, такі як рецептори, які активують проліферацію пероксисом (ГТПАР) (Bonizzi G., Karin M. The two NFkappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity // Trends Immunol.-2004.Vol.25.-P.280-288.; Bottex-Gauthier C, Pollet S., Favier A.,Vidal D.R. The Rel/NF-kappa-B transcription factors complex role in cell regulation // Pathol. Biol. (Paris).-2002.-Vol. 50.-P. 204-211). В лікуванні будь-якої патології, пов'язаної з порушенням внутрішньоклітинного механізму, залучені NF-kB-сигнальні шляхи. Тому модуляція функціонування NF-kB є необхідним фактором в терапії багатьох захворювань. В зв'язку з цим втручання має бути вузько направленим та прицільно дозованим для забезпечення терапевтичного ефекту, не провокуючи погіршення самопочуття. Відомо декілька десятків ендогенних та екзогенних агентів, здатних пригнічувати активність NF-kB. До цієї групи препаратів належать кортикостероїди, імунодепресанти та ін. Є дані, що деякі нестероїдні препарати, такі як аспірин, повністю пригнічують 1-кВ-кіназний комплекс (ΙΚΚβ), а сульфосалазін здатний блокувати транспорт NF-kB в ядро за рахунок пригнічення деградації I-kB (Sheri M.F., Cleaveland J.S., Grosmaire L.S. A D-amino acid peptide inhibitor of NFkB nuclear localization is efficacious in models of inflammatory disease // J. Immunol. - 2000. - Vol. 2. - P. 1004 - 1012.; Транскрипційний фактор NF-kB як мета для подолання радіорезистентності пухлини / І.А. Громакова, П.П. Сорочан, Н.Е. Прохач // Укр. радіологічний журнал. - 2011. - Т. 19. - С. 85 - 89.; Yamamoto Y., Gaynor R.B. Therapeutic potential of inhibition of the NF-κΒ pathway in the treatment of inflammation and cancer // J. Clin. Invest. - 2001. - Vol.107. - P.135 - 142.). Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб використання похідних фумарової кислоти як інгібітор NF-kB (Пат. 2282440 Российская Федерация, МПК А61К 31/194, А61К 31/225, А61Р 43/00. Приемопередающее устройство / Джоши Р.К., Штребель Х.П., Петцельбауэр П.; заявитель и патентообладатель Фумафарм АГ. - №2003124751/15; заявл. 08.01.2002; опубл. 27.08.2006, Бюл. №18). Для здійснення цього способу використовували одно або декілька незаміщених або заміщених діалкілових ефірів фумарової кислоти та моноалкілових ефірів фумарової кислоти як специфічного інгібітора транскрипції NF-kB-залежного гену. Похідні фумарової кислоти застосовували в фармацевтичній композиції для лікування NF-kB-опосередкованих захворювань. Загальними ознаками способу, що заявляється, і найближчого аналога є: 1. застосування фармацевтичних препаратів як модуляторів NF-kB; 2. пригнічення активності NF-kB; 3. дослідження експресії NF-kB методом проточної цитофлюориметрії. Недоліками відомого способу є: 1. широкий спектр дій ефірів фумарової кислоти - складової частини фармацевтичних композицій, що виключає специфічність їх дії на експресію NF-kB; 2. відсутність можливості доведення залучення ΠΠΑΡ-γ в регулюванні активності NF-kB; 3. недосконалість оцінки NF-kB, що обумовлено застосуванням культур клітин; 4. відсутність диференційованого аналізу експресії NF-kB в окремих субпопуляціях клітин. В основу корисної моделі поставлена задача створити такий спосіб модуляції внутрішньоклітинної експресії ядерного фактору кВ, шляхом удосконалення відомого, який дозволяє пригнічувати активність NF-kB, використовуючи агоніст ΠΠΑΡ- рецепторів піоглітазон, доводить залучення ΠΠΑΡ- в регулюванні активності NF-kB мононуклеарів периферійної крові, + забезпечує диференційований аналіз експресії даного фактору серед CD64 клітин поруч з оцінкою процесів апоптозу цих клітин методом проточної цитофлюориметрії. Поставлена задача вирішується шляхом створення способу модуляції внутрішньоклітинної експресії ядерного фактору кВ, що включає застосування фармацевтичних засобів з метою модуляції NF-kB, який відрізняється тим, що як фармацевтичний засіб використовується агоніст ΠΠΑΡ- рецепторів піоглітазон. Запропонований спосіб дозволяє пригнічувати внутрішньоклітинну експресію ядерного фактору кВ через активацію ΠΠΑΡ- та надає можливість вивчити участь ΠΠΑΡ- рецепторів в 1 UA 72146 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 регуляції активності NF-kB, який відіграє одну з провідних ролей в реалізації запалення, онкогенезу, тощо. Заявлений спосіб виконується наступним чином: Модуляція внутрішньоклітинної експресії ядерного фактору кВ здійснюється in vitro з попереднім виділенням мононуклеарів периферійної крові (МНПК) людини та подальшою оцінкою експресії NF-kB цитофлюориметричним методом. Цитофлюориметричний аналіз здійснюють з використанням моноклональних антитіл (мкАТ) до субодиниці р65 молекули NF-kB (BD Biosciences Pharmingen, США). Дію агоніста ΠΠΑΡ- визначали шляхом застосування гідрохлориду піоглітазону (ΡΙΟ) в концентраціях 10, 30 та 100 Μ, який попередньо був розчинений в диметилсульфоксиді (DMSO). Для дослідження використовували суспензію МНПК, яку отримували з периферійної крові в асептичних умовах за стандартною методикою [Лимфоциты: методы: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Клауса. - М.: Мир, 1990. - 395 с.] шляхом центрифугування на градієнті густини фіколверографіну (густина 1,077 г/мл) із наступним відмиванням стерильним фосфатно-сольовим . 6 буфером (ФСБ) та подальшим ресуспендуванням до концентрації 2 10 клітин в 1 мл в середовищі RPMI-1640 з глютаміном (Sigma, США) з 10% інактивованою телячою сироваткою ("Bio Mark Іnс", Львів Україна), 100 мкг/мл гентаміцину сульфату (ГНЦЛС, Україна) при 37°С в присутності ΡΙΟ, або DMSO, або ФСБ в контрольних групах. Суспензії свіжовиділених МНПК та через 18 год. інкубації двічі відмивали для подальшого визначення внутрішньоклітинної + експресії ядерного фактору кВ. Для визначення експресії NF-kB CD64 клітинами суспензію МНПК попередньо інкубували в присутності мкАТ до поверхневих антигенів CD64. Апоптоз МНПК оцінювали методом проточної лазерної цитофлюориметрії з використанням анексину V-FITC та пропідіуму йодиду (РІ) (виробництва Caltag, США). Для виявлення змін постановку методик проводили, використовуючи суспензію МНПК, безпосередньо після виділення клітин, після інкубації в присутності ΡΙΟ, DMSO та ФСБ. Статистичну обробку результатів досліджень проводили, використовуючи пакет програми STATISTICA 6.0 (StatSoft, США), з розрахунком вибіркового середнього, вибіркового стандартного відхилення, вірогідності отриманих результатів Т-тестом для попарнозв'язаних величин (t). Дані наведені у вигляді вибіркового середнього (М), вибіркового стандартного відхилення (STD). Критичний рівень значимості під час перевірки статистичних гіпотез в данному дослідженні приймали за 0,05. Під час дослідження змін показників під впливом агоніста ΠПΑΡ- -піоглітазону - були враховані зміни в контрольних пробах. Статистична обробка результатів показала, що в контрольній пробі після 18 год. інкубації в поживному середовищі та в присутності DMSO + (розчинник піоглітазону) зменшилась кількість CD64 клітин в суспензії МНПК, при цьому в 1,5 рази збільшився рівень максимальної експресії відповідних рецепторів (Табл.). Як видно з даних, представлених в таблиці, активація ΠΠΑΡ- в найбільшій експериментальній дозі + призводила до вірогідного зменшення кількості клітин, що експресували CD64 та максимальних рівнів експресії цих рецепторів. Під час досліджень концентрації NF-kB в суспензії МНПК нами показано, що під впливом DMSO відбувалося зменшення показників досліджуваних клітин в інкубаційному середовищі. При цьому на фоні дії піоглітазону, починаючи з дози 30μΜ, що відповідає середньотерапевтичній дозі, експресія даного показника прогресивно зменшувалась. Аналогічне дозозалежне зменшення концентрації NF-kB та рівня експресії досліджуваного + показника спостерігалось серед CD64 клітин. Аналізуючи рівні апоптозу серед МНПК під + + впливом активатора ΠΠΑΡ-γ, що відображає кількість AnV PI клітин в суспензії, відмічено дозозалежне зменшення апоптотичних клітин. При цьому максимальні вірогідні зміни + + спостерігались під впливом піоглітазону в дозі 100μΜ (вдвічі зменшення кількості AnV PI клітин). Отримані результати дозволяють довести, що активація ΠΠΑΡ- призводить до пригнічення експресії ядерного фактору кВ, що свідчить про залучення ΠΠΑΡ- в регуляції активності NF-kB , перспективу вивчення модуляції NF-kB та розробки нових можливостей терапевтичних втручань. Спосіб модуляції внутрішньоклітинної експресії ядерного фактору кВ 2 UA 72146U Таблиця + Вплив піоглітазону на рівень експресії NF-kB та процесів апоптозу в суспензії МНПК Свіжовиділені МНПК Контроль 18год. інкубації Контроль Піоглітазон DMSO 10 μΜ + Кількість CD64 клітин Максимальний рівень експресії + CD64 + Кількість NF-kB клітин Максимальний рівень експресії NF-kB+ Кількість + + CD64 NF-kB клітин + + Кількість AnV РІ клітин 5 88,3±6,3 83,5±9,9 3,7±2,1 79,4±1 5,7±1,0# 51,3±37,1 14,8±2,5 5,8±2,9 71,8±22, 8 1,6±0,8 58,0±36,2 0,6 54,8±3 1,4 2,8±1,2# 2,7±1,8 83,5±24, 3 69,0±3 1,9 3,9±2,5# 6,8±3,9 # Піоглітазон 30μΜ Піоглітазон 100 μΜ 50,7±23,3 79,6+11,2 79,5±9,6 5,6±1,0 4,6±1,3 1,6±0,6* 54,9±29,5 51,1±35,3 33,2±28,8 2,3±1,2 2,1±1,0 1,8±1,0 69,6±32,8 64,1±37,4 62,5±22,0 5,6±2,9 4,5±4,2 3,7±2,2* * Примітка: # - вірогідність відмін в порівнянні з показниками в суспензії свіжовиділених МНПК; * - вірогідність відмін в порівнянні з показниками контрольних проб (DMSO) . ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Спосіб модуляції внутрішньоклітинної експресії ядерного фактору kВ, що включає застосування фармацевтичних засобів для модуляції NF-kB, який відрізняється тим, що як фармацевтичний засіб використовується агоніст ΠΠΑΡ-γ рецепторів піоглітазон. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3