Спосіб індукції апоптозу мононуклеарних клітин

Реферат: Спосіб індукції апоптозу мононуклеарних клітин включає їх виділення, індукцію апоптозу та його оцінку. Як індуктор використовується активатор ΠΠΑΡ-γ рецепторів піоглітазон. UA 72144 U (54) СПОСІБ ІНДУКЦІЇ АПОПТОЗУ МОНОНУКЛЕАРНИХ КЛІТИН UA 72144 U UA 72144 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель стосується галузей біології та медицини та може бути використана для індукції апоптозу клітин імунної системи при патологіях, що супроводжуються запальним процесом. Доведена роль апоптозу у розвитку багатьох патологічних процесів та станів, таких, як злоякісні новоутворення, синдром набутого імунодефіциту, деякі нейродегенеративні та аутоімунні захворювання, інфекційні процеси та ін. (Кайдашев И. П. Апоптоз - как общебиологический процесс // Проблемы экологии и медицины. - 1998 - Т. 2, № 5. - С. 9-13; Ярилин А. А. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и при патологии // Актуальные проблемы патофизиологии. Под ред. Б. Б. Мороза. - М.: Медицина, 2001. - С. 13-56.). Отже, беззаперечним напрямком в сучасній імунології є застосування чинників, які б стимулювали індукцію апоптозу імунокомпетентних клітин, активація яких призводить до розвитку запальних процесів. З літературних джерел відомо, що ППАР- та ΠΠΑΡ- здійснюють негативний регуляторний вплив на перебіг запального процесу та впливають на функціонування Τ лімфоцитів, моноцитів/макрофагів, дендритних клітин та тучних клітин [Clark R.B., Bishop-Bailey D., EstradaHernandez Т., Hla Т., Puddington L., Padula S.I. The nuclear receptor PPAR gamma and immunoregulation: PPAR gamma mediates inhibition of helper Τ cell responses // J. Immunol. - 2000. - Vol. 164. - P. 1364-1371., Moore K. J., Rosen E. D., Fitzgerald M. L., Randow F., Andersson L. P., Altshuler D., Milstone D. S., Mortensen R. M., Spiegelman B. M., Freeman M. W. The role of PPAR gamma in macrophage differentiation and cholesterol uptake // Nat. Med. - 2001. - Vol.7. - P.41-47.]. Така протизапальна функційна активність ΠΠΑΡ- сьогодні привертає увагу науковців різних галузей медицини. Відомі способи індукції апоптозу лімфоцитів за допомогою глюкокортикостероїдів (Бойчук С. В., Мустафин И. Г., Фассахов Р. С., Терещенко Д. В. Спонтанный и глюкокортикоид индуцированный апоптоз лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой: роль митохондрий и CD95 (АРО-1) // Аллергология. - 2002. - №1. - С. 13-20.), моноклональних антитіл BION-1, які призводять до блокування продукції лімфоцитами запальних цитокінів IL-5, GM-CSF і TL-3 (Ramshaw H. S., Woodcock J. M., Bagley C. J., McClure BJ, Hercus T. R., Lopez A. F. New approaches in the treatment of asthma // Immunol. Cell Biol. - 2001. - Vol. 79, № 2. - P. 154-159.), моноклональними антитілами до HLA-A, -В, -С, HLA-DR та CD95 молекул (Мамонтова Т. В., Кайдашев И. П. Состояние CD95-, MHCI- и MHCII-опосредованного апоптоза у больных атопической бронхиальной астмой // Иммунология. - 2004. - № 4. - С. 198-201.). Найбільш близьким до способу по технічному результату та функціональному призначенню є спосіб корекції апоптозу мононуклеарних клітин периферійної крові шляхом використання селективного блокатора Н3-гістамінових рецепторів тіопераміду, який прийнято за прототип (Пат. UA №35668 U, МПК 51 А61К 38/00, А61В 10/00, опубл. Бюл. № 18, 2008). Для здійснення цього способу використовували мононуклеари периферійної крові (МНПК) людей. Суспензії клітин готували шляхом виділення мононуклеарів з периферійної венозної крові центрифугуванням в одноступеневому градієнті щільності фікол-верографіні. Для стимуляції апоптозу використовували селективний блокатор Н 3-гістамінових рецепторів тіоперамід, який вносили у середовище культивування в концентраціях 1 mM, 10 mМ та 100 mМ в двох паралелях та інкубували протягом 24, 48 та 72 год. З метою комплексної оцінки процесів апоптозу використовували метод проточної лазерної цитофлюориметрії з використанням анексину V-FITC та пропідіум йодиду (РІ). Загальними ознаками способу, що заявляється, і найближчого аналога є: 1) виділення мононуклеарних клітин периферійної крові; 2) індукція апоптозу мононуклеарних клітин периферійної крові; 3) оцінка апоптозу. Недоліком відомого способу є відсутність можливості доведення залучення ΠΠΑΡ- в регулюванні процесів апоптозу імунокомпетентних клітин. В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб індукції апоптозу мононуклеарних клітин периферійної крові шляхом удосконалення відомого, який дозволяє стимулювати апоптоз імунокомпетентних клітин активатором ΠΠΑΡ- рецепторів піоглітазоном, доводить залучення ΠΠΑΡ- в регулюванні процесів апоптозу мононуклеарних клітин, забезпечує достовірну оцінку процесів апоптозу лімфоцитів методом проточної цитофлюориметрії з метою модулювання функціонального стану імунної системи людини. Поставлена задача вирішується шляхом створення способу індукції апоптозу мононуклеарних клітин, що включає їх виділення, індукцію апоптозу та його оцінку, який відрізняється тим, що як індуктори використовується активатор ΠΠΑΡ- рецепторів піоглітазон. 1 UA 72144 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Запропонований спосіб дозволяє індукувати апоптоз через активацію ΠΠΑΡ- та надає можливість вивчити участь ΠΠΑΡ- рецепторів в регуляції функціональної активності мононуклеарних клітин периферійної крові, які реалізують свої ефекти в процесах запалення, онкогенезі, тощо. Заявлений спосіб виконується наступним чином: Індукція апоптозу здійснюється in vitro з попереднім виділенням мононуклеарів периферійної крові людини та подальшою комплексною оцінкою апоптозу цитофлюориметричним методом. Цитофлюориметричний аналіз здійснюють з використанням флюорисцентних барвників анексину V-FITC (AnV) та пропідіуму йодиду (РІ). Дію агоніста ΠΠΑΡ- визначали шляхом застосування гідрохлориду піоглітазону (ΡΙΟ) в концентраціях 10, 30 та 100 μΜ, який попередньо був розчинений в диметилсульфоксиді (DMSO). Для дослідження використовували суспензію мононуклеарів периферійної крові (МНПК), яку отримували з периферійної крові в асептичних умовах за стандартною методикою [Лимфоциты: методы: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Клауса. - М.: Мир, 1990. - 395с] шляхом центрифугування на градієнті густини фікол-верографіну (густина 1,077 г/мл) із наступним відмиванням стерильним фосфатно-сольовим буфером (ФСБ) та подальшим 6 ресуспендуванням до концентрації 210 клітин в 1 мл в середовищі RPM1-1640 з глютаміном (Sigma, США) з 10 % інактивованою телячою сироваткою („Вio Mark Inc", Львів Україна), 100 мкг/мл гентаміцину сульфату (ГНЦЛС, Україна) при 37 °С в присутності РIO, або DMSO, або ФСБ в контрольних групах. Суспензії свіжевиділених МНПК та через 18 год. інкубації двічі відмивали для подальшого визначення апоптозу. Апоптоз МНПК оцінювали методом проточної лазерної цитофлюориметрії з використанням AnV-FlTC та РІ (виробництва Caltag, США). Статистичну обробку результатів досліджень проводили, використовуючи пакет програми STATISTICA 6.0 (StatSoft, США) з розрахунком вибіркового середнього, вибіркового стандартного відхилення, вірогідності отриманих результатів Т-тестом для попарнозв'язаних величин (t). Дані наведені у вигляді вибіркового середнього (М), вибіркового стандартного відхилення (STD). Критичний рівень значимості під час перевірки статистичних гіпотез в данному дослідженні приймали за 0,05. Під час дослідження змін показників під впливом агоніста ΠΠΑΡ- -піоглітазону - були враховані зміни в контрольних пробах. Статистична обробка результатів показала, що в контрольній пробі після 18 год. інкубації в поживному середовищі та в присутності DMSO + + (розчинник піоглітазону) спостерігались зміни кількості AnV PI клітин в суспензії МНПК. Під впливом DMSO відмічена індукція процесів апоптозу, порівнюючи з показниками в контрольній пробі. Аналізуючи рівні апоптозу серед МНПК під впливом активатора ΠΠΑΡ-, що відображає + + кількість AnV PI клітин в суспензії, відмічено дозозалежне зменшення апоптотичних клітин. При цьому максимальні вірогідні зміни спостерігались під впливом піоглітазону в дозі 100 μΜ (вдвічі + + зменшення кількості AnV PI клітин). Отримані результати дозволяють довести, що активація ΠΠΑΡ- задіяна в регуляції апоптотичних процесів МНПК, що відкриває нам ще один шлях для дослідження складних механізмів програмованої загибелі імунокомпетентних клітин та нових можливостей терапевтичних втручань. Таблиця Вплив піоглітазону на процеси апоптозу МНПК Свіжовиділені МНПК Кількість + + AnV PI 14,8±2,5 клітин Контроль 18 Контроль год. інкубації DMSO Піоглітазон 10 μΜ Піоглітазон 30 μΜ Піоглітазон 100 μΜ 3,9±2,5# 5,6±2,9 4,5±4,2 3,7±2,2* 6,8±3,9# 45 Примітка: # - вірогідність відмін в порівнянні з показниками в суспензії свіжовиділених МНПК; * - вірогідність відмін в порівнянні з показниками контрольних проб (DMSO). 50 2 UA 72144 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб індукції апоптозу мононуклеарних клітин, що включає їх виділення, індукцію апоптозу та його оцінку, який відрізняється тим, що як індуктори використовується активатор ΠΠΑΡ-γ рецепторів піоглітазон. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3