Спосіб ідентифікації натуральних сd25+fохр3+ регуляторних т-клітин (ntreg) у гістологічних зрізах

Реферат: + + Спосіб ідентифікації натуральних CD25 Foxp3 регуляторних Т-клітин (nTreg) у гістологічних зрізах шляхом підготовки гістологічних препаратів і проведення мікроскопічного дослідження з використанням специфічних маркерів. Крім того, проводять подвійну імунофлюоресцентну реакцію з використанням маркерів до CD25 та транскрипційного фактору Foxp3, кон'югованих з різними флуоресцентними барвниками - FITC та Texas Red. UA 72775 U (12) UA 72775 U UA 72775 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель стосується медицини, зокрема експериментальної медицини, патологічної фізіології, ендокринології, імуноморфології, і може бути використана для вивчення функціонального стану лімфоїдної тканини в умовах норми та при патологічних станах. Численні дослідження останніх років свідчать, що важливу роль у забезпеченні імунологічної аутотолерантності і негативному контролі як патологічних, так і фізіологічних + + імунних реакцій відіграє популяція натуральних CD25 Foxp3 регуляторних Т-клітин (nTreg). Елімінація або інактивація цих клітин викликає розвиток важких автоімунних захворювань, а також призводить до посилення імунної відповіді на алоантигени і пухлинні клітини. Існують деякі лектингістохімічні та імунофлюоресцентні способи виявлення лімфоцитів у гістологічних препаратах за наявністю рецепторів до лектинів та протеїнів, але вони недостатньо специфічні, що зумовило необхідність розробки нових способів. Найбільш близьким за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб, який полягає у виявленні В-лімфоцитів шляхом підготовки гістологічного препарату і проведенні лектингістохімічного дослідження з використанням специфічного маркеру - лектину кори бузини чорної [Волошин М. А., Кущ О. Г. Пат. № 13282, UA, МПК 2006 G01N 21/00]. Спільні суттєві ознаки прототипу й корисної моделі, що заявляється: - підготовка гістологічних препаратів; - проведення мікроскопічного дослідження з використанням специфічного маркеру. Цей спосіб є недостатньо ефективним, оскільки не дозволяє високоспецифічно виявляти nTreg в гістологічних зрізах кишковоасоційованої лімфоїдної тканини (КАЛТ). В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу ідентифікації + + натуральних CD25 Foxp3 регуляторних Т-клітин (nTreg) у гістологічних зрізах шляхом використання моноклональних антитіл до CD25 та транскрипційного фактору Foxp3, як найбільш специфічних маркерів, що дозволить підвищити ефективність специфічного виявлення цих клітин. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає підготовку гістологічних препаратів і проведення мікроскопічного дослідження з використанням специфічного маркеру новим є те, що проводять подвійну імунофлюоресцентну реакцію з використанням маркерів до CD25 та транскрипційного фактору Foxp3, кон'югованих з різними флуоресцентними барвниками - FITC та Texas Red. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у наступному. Постановка подвійної імунофлюоресцентної реакції з використанням маркерів до CD25 та транскрипційного фактору Foxp3 для виявлення nTreg в гістологічних препаратах дозволить зменшити помилки при підрахунку цих клітин у гістологічних препаратах та оцінити ступінь активності спадкового та набутого імунітету в умовах норми та при патологічних станах, оскільки CD25 та транскрипційний фактор Foxp3 є високоспецифічними маркерами для nTregклітин. До переваг подвійного імунофлюоресцентного визначення nTreg належить наступне: популяція регуляторних Т-клітин включає в себе не тільки "професійні", повністю + + диференційовані натуральні супресорні клітини CD25 Foxp3 (nTreg), але й регуляторні Т+ клітини, що диференціюються з наївних периферичних СО4 -Т-клітин в процесі відповіді на антиген, так звані адаптивні (індуцибельні) iTreg: Tr1 і Тh3-клітини, супресорна активність яких обумовлена продукцією ними цитокінів IL-10 і TGF- відповідно. Ці клітини характеризуються низьким рівнем або повною відсутністю експресії транскрипційного фактора Foxp3 і високим high рівнем експресії CD25 (CD25 ). Тому, використовуючи лише поверхневий маркер CD25 неможливо встановити походження цих клітин, тоді як методом подвійної флюоресценції можливо безпомилково виділити популяцію nTreg. Запропонований спосіб дозволяє високоспецифічно диференціювати nTreg від інших клітин у гістологічних препаратах. Ця специфічна імунофлюоресцентна реакція дозволить аналізувати функціональний стан Тлімфоцитів та проводити кількісний аналіз імунорегуляторних nTreg-клітин в центральних та периферичних органах імунної системи. Таким чином, сукупність зазначених позитивних моментів дозволить підвищити ефективність виявлення nTreg у гістологічних зрізах КАЛТ і підвищити якість оцінки функціонального стану імунної системи в умовах стресу та при розвитку автоімунної патології. Спосіб здійснюють таким чином. Для проведення даного дослідження на ротаційному мікротомі MICROM HR-360 (Microm, Німеччина) робили 5-мікронні серійні зрізи з різних ділянок клубової кишки щурів, фіксованої за Буеном, які потім депарафінували в ксилолі, проводили регідратацію в низхідних концентраціях 1 UA 72775 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 етанолу (100 %, 96 %, 70 %), відмивали у фізіологічному розчині або 0,1 М фосфатному буфері (рН = 7,4) і фарбували моноклональними антитілами. Досліджені 3 морфологічні зони згрупованих лімфоїдних вузликів клубової кишки щурів лімфоїдні фолікули, міжвузликову й підепітеліальну, а також між- і внутрішньоепітеліальні лімфоцити та лімфоцити в підслизовій основі кишки. Метод подвійної імунофлюресценції для виявлення nTreg полягав в наступному. Гістологічні зрізи інкубували одночасно з первинними мишачими моноклональними антитілами (МКАТ) до Foxp3 щурів виробництва Santa Cruz Biotechnology (США) та з МКАТ до CD25 щурів (клон ОХ39), вже кон'югованими з FITC (Caltag Laboratories, США) протягом 18 годин у вологій камері при Т = 4 °C. Після відмивання надлишку первинних антитіл в 0,1 М фосфатному буфері зрізи інкубували 60 хвилин (Т = 37 °C) з вторинними антитілами в розведенні 1:64. Як вторинні антитіла використовували козячі антитіла до повної молекули IgG миші, кон'югованих з Texas Red (Santa Cruz Biotechnology, США). Після інкубації зрізи промивали 0,1 М фосфатним буфером і занурювали в суміш гліцерину й фосфатного буфера (1:9) для подальшої люмінесцентної мікроскопії. Оброблені гістологічні зрізи вивчали за допомогою комп'ютерної програми ImageJ (Image Processing and Data Analysis in Java), спеціально розробленої для аналізу медичних і біологічних зображень (розробник -National Institutes of Health, США). Зображення, отримане на мікроскопі AXIOSKOP (ZEISS, Німеччина) в ультрафіолетовому спектрі з довжиною хвилі 390 нм (FITC) або 595 нм (Texas Red), за допомогою високочутливої камери AxioCam 5c (ZEISS, Німеччина) негайно вводять у комп'ютер. При цьому ефект "вигорання" препарату, пов'язаний з поступовим руйнуванням молекули FITC або Texas Red під впливом тривалого ультрафіолетового опромінення, виключено. При цьому в ручному режимі визначали області зі статистично значущою флюоресценцією, характерною для лімфоїдних клітин, що експресують Foxp3 або CD25. Обчислювали площу імунопозитивних лімфоїдних клітин, їх периметр, діаметр. Накладання ідентичних знімків у комп'ютерній програмі дозволяло ідентифікувати клітини, які одночасно експресують Foxp3 та CD25. Приклад Після фіксації шматочків клубової кишки щурів у розчині Буена їх зневоднюють у висхідній батареї спиртів, отримують парафінові зрізи 5-6 мкм завтовшки та виготовляють гістологічні препарати. Гістологічні зрізи інкубували одночасно з первинними мишачими моноклональними антитілами (МКАТ) до Foxp3 щурів виробництва Santa Cruz Biotechnology (США) та з МКАТ до CD25 щурів (клон ОХ-39), вже кон'югованих з FITC (Caltag Laboratories, США) протягом 18 годин у вологій камері при Т = 4 °C. Після відмивання надлишку первинних антитіл в 0,1 М фосфатному буфері зрізи інкубували 60 хвилин (Т = 37 °C) з вторинними антитілами в розведенні 1:64. У якості вторинних антитіл використовували козячі антитіла до повної молекули IgG миші, кон'югованих з Texas Red (Santa Cruz Biotechnology, CШA). Після інкубації зрізи промивали 0,1 М фосфатним буфером і занурювали в суміш гліцерину й фосфатного + + буфера (1:9) для подальшої люмінесцентної мікроскопії. Для ідентифікованих CD25 Foxp3 регуляторних Т-клітин за допомогою комп'ютерної програми ImageJ обчислювали площу, їх + + периметр, діаметр. У результаті класифікаційного аналізу ідентифікували CD25 Foxp3 2 + + імунопозитивні лімфобласти площею (Аrеа)> = 30,0 мкм ; CD25 Foxp3 великі лімфоцити 30,0> + + + + Аrеа> = 16,0; CD25 Foxp3 середні лімфоцити 16,0> Аrеа> = 11,0; CD25 Foxp3 малі лімфоцити 2 11,0> Аrеа> = 5,0. Це дозволило обчислити абсолютну (кількість клітин на 1 мм площі кишки) і + + відносну (%) щільність розподілу СО25 РохрЗ -імунопозитивних лімфоцитів різних класів у досліджуваних зонах згрупованих лімфоїдних вузликів клубової кишки щурів. + + При експериментальному цукровому діабеті та в умовах соціального стресу СВ25 Рохр3 імунопозитивні лімфоцити виявляються в лімфоїдних вузликах, міжвузликовій і підепітеліальній зоні, а також у підслизовій основі кишки щурів лінії Вістар. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ + 55 + Спосіб ідентифікації натуральних CD25 Foxp3 регуляторних Т-клітин (nTreg) у гістологічних зрізах шляхом підготовки гістологічних препаратів і проведення мікроскопічного дослідження з використанням специфічних маркерів, який відрізняється тим, що проводять подвійну імунофлюоресцентну реакцію з використанням маркерів до CD25 та транскрипційного фактору Foxp3, кон'югованих з різними флуоресцентними барвниками - FITC та Texas Red. 2 UA 72775 U Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3