Спосіб ідентифікації т-хелперів 17 типу (th17)

Реферат: Спосіб ідентифікації Т-хелперів 17 типу (Тh 7) шляхом підготовки гістологічних препаратів і проведення мікроскопічного дослідження з використанням специфічного маркера. Крім того, імунофлюоресцентну реакцію проводять з використанням маркера до ядерного orphanрецептора RORt, додатково визначають морфометричні й денситометричні показники, зокрема площу імунопозитивних клітин, інтегровану оптичну щільність (Integrated Density) і середнє значення сірого (Mean Gray Value), а також розраховують коректний показник клітинної флюоресценції за формулою: CTCF=Integrated Density - (Area of selected cell * Mean fluorescence of background readings), де CTCF - коректний показник клітинної флюоресценції (corrected total cell fluorescence), Area of selected cell - площа виділених клітин, Mean fluorescence of background readings - середній показник флюоресценції фону. UA 72776 U (12) UA 72776 U UA 72776 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель стосується медицини, зокрема експериментальної медицини, патологічної фізіології, ендокринології, імуноморфології, і може бути використана для вивчення функціонального стану лімфоїдної тканини в умовах норми та при патологічних станах. Основними ефекторами розвитку запальних та автоімунних захворювань є представники однієї з субпопуляцій Т-лімфоцитів хелперів - Т-хелпери 17 типу. Незважаючи на велику кількість молекул, що експресуються Тh7-клітинами і претендують на роль їх маркерів, мабуть, найнадійнішими є транскрипційні фактори, пов'язані з ядерним orphan-рецептором (Retinoic acid-related orphan receptors, RORs). Одну з ізоформ ROR-RORt - вперше виявлено в тимусі, вони отримали назву TOR (thymus orphan receptor). Однак надалі експресію RORt виявлено й у периферичних органах імунної системи: селезінці, лімфатичних вузлах тощо. Існують лектингістохімічні та імунофлюоресцентні способи виявлення лімфоцитів у гістологічних препаратах за наявністю рецепторів до лектинів і протеїнів, але вони недостатньо специфічні, що зумовило необхідність розробки нових способів. Найближчим за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб, що полягає у виявлені лімфоцитів шляхом підготовки гістологічного препарату і проведенні лектингістохімічного дослідження з використанням специфічного маркера - лектину кори бузини чорної [Волошин М. А., Кущ О. Г. Пат. № 13282, UA, МПК 2006 G01N21/00]. Спільні суттєві ознаки прототипу й корисної моделі, що заявляється: - підготовка гістологічних препаратів; - здійснення мікроскопічного дослідження з використанням специфічного маркера. Цей спосіб є недостатньо ефективним, оскільки не дозволяє високоспецифічно виявляти Тхелпери 17 типу (Тh 7) в гістологічних зрізах кишковоасоційованої лімфоїдної тканини (КАЛТ). В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу ідентифікації Тхелперів 17 типу (Тh 7) шляхом використання моноклонального антитіла до транскрипційного фактора RORt як найбільш специфічного маркера, що дозволить підвищити ефективність специфічного виявлення цих клітин і здійснювати кількісне визначення експресії RORt. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає підготовку гістологічних препаратів і проведення мікроскопічного дослідження з використанням специфічного маркера, новим є те, що імунофлюоресцентну реакцію проводять з використанням маркера до ядерного orphan-рецептора RORt, додатково визначають морфометричні й денситометричні показники, зокрема площу імунопозитивних клітин, інтегровану оптичну щільність (Integrated Density) і середнє значення сірого (Mean Gray Value), а також розраховують коректний показник клітинної флюоресценції за формулою: CTCF=Integrated Density - (Area of selected cell * Mean fluorescence of background readings), де CTCF - коректний показник клітинної флюоресценції (corrected total cell fluorescence), Area of selected cell - площа виділених клітин, Mean fluorescence of background readings - середній показник флюоресценції фону. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у наступному. Постановка імунофлюоресцентної реакції з RORt для виявлення Тh 7 у гістологічних препаратах дозволить зменшити помилки при підрахунку цих клітин у гістологічних препаратах та оцінити ступінь активності спадкового та набутого імунітету в умовах норми та при патологічних станах, оскільки транскрипційний фактор RORt є високоспецифічним маркером для Тh 7-клітин. До переваг імунофлюоресцентного визначення Тh 7 належить наступне: гістологічні зрізи фіксують на скельцях з адгезивним покриттям, що запобігає їх спонтанній руйнації, після цього дослідник не лімітується у жорстких часових умовах здійснення дослідження; для проведення методики можна використовуватифлуоресцентні мікроскопи та моноклональні антитіла різних виробників; якість реакції також значно підвищується за рахунок застосування вторинних антитіл; як систему аналізу зображення можна використовувати різні доступні ліцензовані системи, окремі з них (програма аналізу ImageJ, NIH, USA) є безкоштовними. За допомогою програми ImageJ можна як в автоматичному, так і в мануальному режимі розрізняти окремі імунопозитивні лімфоцити. Результати дослідження документують у вигляді фотографій. Головною перевагою імунофлюоресцентного дослідження є можливість отримати унікальну характеристику кожного окремого лімфоциту з позицій його морфології та функцій. Методика дозволяє пов'язати інтенсивність експресії будь-якого лімфоцитарного рецептора з такими морфометричними показниками, як площа, діаметр, периметр лімфоциту тощо. Запропонований спосіб дозволяє високоспецифічно диференціювати Тh 7 від інших клітин у гістологічних препаратах і кількісно визначати експресію RORt, враховуючи коректний показник клітинної флюоресценції імунопозитивних клітин. 1 UA 72776 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Ця специфічна імунофлюоресцентна реакція дозволить аналізувати функціональний стан Тлімфоцитів і здійснювати кількісний аналіз прозапальних Тh17-клітин у центральних і периферичних органах імунної системи. Кількісне визначення концентрації білка RORt в лімфоїдних клітинах дозволяє з високим ступенем специфічності ідентифікувати Тh 7 у гістологічних зрізах. Отже, сукупність зазначених позитивних моментів дозволить підвищити ефективність виявлення Тh17-клітин у гістологічних зрізах КАЛТ і підвищити якість оцінки функціонального стану імунної системи в умовах стресу та при розвитку автоімунної патології. Спосіб здійснюють таким чином. Для здійснення дослідження на ротаційному мікротомі MICROM HR-360 (Microm, Німеччина) робили 5-мікронні серійні зрізи з різних ділянок клубової кишки щурів, фіксованої за Буеном, які потім депарафінували в ксилолі, проводили регідратацію в низхідних концентраціях етанолу (100 %, 96 %, 70 %), відмивали у фізіологічному розчині або 0,1 М фосфатному буфері (рН =7,4) і фарбували моноклональними антитілами. Досліджено 3 морфологічні зони згрупованих лімфоїдних вузликів клубової кишки щурів: лімфоїдні фолікули, міжвузликову й підепітеліальну, а також між- і внутрішньоепітеліальні лімфоцити та лімфоцити в підслизовій основі кишки. Клітинний антигенний маркер RORt виявляли непрямим імунофлюоресцентним методом за допомогою первинних кролячих моноклональних антитіл до RORt щурів виробництва Santa Cruz Biotechnology (США), з якими гістологічні зрізи інкубували протягом 18 годин у вологій камері при Т = 4 °C. Після відмивання надлишку первинних антитіл в 0,1 М фосфатному буфері зрізи інкубували 60 хвилин (Т = 37 °C) з вторинними антитілами в розведенні 1:64. Як вторинні антитіла використовували козячі антитіла до повної молекули IgG кролика, кон'югованих з FITC (Sigma Chemical, США). Після інкубації зрізи промивали 0,1 М фосфатним буфером і занурювали в суміш гліцерину й фосфатного буфера (1:9) для подальшої люмінесцентної мікроскопії. Оброблені гістологічні зрізи вивчали за допомогою комп'ютерної програми ImageJ (Image Processing and Data Analysis in Java), спеціально розробленої для аналізу медичних і біологічних зображень (розробник - National Institutes of Health, США). Зображення, отримане на мікроскопі PrimoStar (ZEISS, Німеччина) в ультрафіолетовому спектрі з довжиною хвилі 390 нм, за допомогою високочутливої камери AxioCam 5c (ZEISS, Німеччина) негайно вводять у комп'ютер. При цьому ефект "вигорання" препарату, пов'язаний з поступовим руйнуванням молекули FITC під впливом тривалого ультрафіолетового опромінення, виключено. При цьому в ручному режимі визначали області зі статистично значущою флюоресценцією, характерною для лімфоїдних клітин, що експресують RORyt. Обчислювали морфометричні й денситометричні показники, зокрема площу імунопозитивних клітин, інтегровану оптичну щільність (Integrated Density) й середнє значення сірого (Mean Gray Value), розраховували коректний показник клітинної флюоресценції за формулою: CTCF=Integrated Density - (Area of selected cell * Mean fluorescence of background readings), де CTCF - коректний показник клітинної флюоресценції (corrected total cell fluorescence), Area of selected cell - площа виділених клітин, Mean fluorescence of background readings - середній показник флюоресценції фону. Приклад Після фіксації шматочків клубової кишки щурів у розчині Буена їх зневоднюють у висхідній батареї спиртів, отримують парафінові зрізи 5-6 мкм завтовшки та виготовляють гістологічні препарати. Клітинний антигенний маркер RORt виявляли непрямим імунофлюоресцентним методом за допомогою первинних кролячих моноклональних антитіл до RORt щурів виробництва Santa Cruz Biotechnology (США), з якими гістологічні зрізи інкубували протягом 18 годин у вологій камері при Т = 4 °C. Після відмивання надлишку первинних антитіл в 0,1 М фосфатному буфері зрізи інкубували 60 хвилин (Т = 37 °C) з вторинними антитілами в розведенні 1:64. Як вторинні антитіла використовували козячі антитіла до повної молекули IgG кролика, кон'югованих з FITC (Sigma Chemical, США). Після інкубації зрізи промивали 0,1 М фосфатним буфером і занурювали в суміш гліцерину й фосфатного буфера (1:9) для подальшої люмінесцентної мікроскопії. Для ідентифікованих RORyt - імунопозитивних клітин лімфоїдних клітин - з використанням комп'ютерної програми ImageJ обчислювали морфометричні й денситометричні показники: площу імунопозитивних клітин, інтегровану оптичну щільність (Integrated Density) і середнє значення сірого (Mean Gray Value), а також розраховували коректний показник клітинної флюоресценції за формулою: CTCF=Integrated Density - (Area of selected cell * Mean fluorescence of background readings), 2 UA 72776 U 5 10 де CTCF - коректний показник клітинної флюоресценції (corrected total cell fluorescence), Area of selected cell - площа виділених клітин, Mean fluorescence of background readings середній показник флюоресценції фону. У результаті класифікаційного аналізу ідентифікували RORt - імунопозитивні лімфобласти 2 + площею (Аrеа)> = 30,0 мкм ; RORt великі лімфоцити 30,0> Аrеа> = 16,0; RORt середні + лімфоцити 16,0> Аrеа> = 11,0; RORt малі лімфоцити 11,0> Аrеа> = 5,0. Це дозволило 2 обчислити абсолютну (кількість клітин на 1 мм площі кишки) і відносну (%) щільність розподілу різних RORt-імунопозитивних лімфоцитів різних класів у досліджуваних зонах згрупованих лімфоїдних вузликів клубової кишки щурів. При експериментальному цукровому діабеті та в умовах соціального стресу RORtімунопозитивні лімфоцити спостерігають в лімфоїдних вузликах, міжвузликовій і підепітеліальній зоні, а також у підслизовій основі кишки. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 Спосіб ідентифікації Т-хелперів 17 типу (Тh 7) шляхом підготовки гістологічних препаратів і проведення мікроскопічного дослідження з використанням специфічного маркера, який відрізняється тим, що імунофлюоресцентну реакцію проводять з використанням маркера до ядерного orphan-рецептора RORt, додатково визначають морфометричні й денситометричні показники, зокрема площу імунопозитивних клітин, інтегровану оптичну щільність (Integrated Density) і середнє значення сірого (Mean Gray Value), а також розраховують коректний показник клітинної флюоресценції за формулою: CTCF=Integrated Density - (Area of selected cell * Mean fluorescence of background readings), де CTCF - коректний показник клітинної флюоресценції (corrected total cell fluorescence), Area of selected cell - площа виділених клітин, Mean fluorescence of background readings - середній показник флюоресценції фону. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3