Спосіб ідентифікації т-фолікулярних хелперів(tfн)

Спосіб ідентифікації Т-фолікулярних хелперів (Tfh), що включає підготовку гістологічних препаратів і проведення мікроскопічного дослідження з використанням специфічного маркера, який відрізняється тим, що проводять імунофлюоресцентну реакцію з використанням специфічного маркера ICOS. (19) (21) u201108542 (22) 07.07.2011 (24) 10.01.2012 (46) 10.01.2012, Бюл.№ 1, 2012 р. (72) КАМИШНИЙ ОЛЕКСАНДР МИХАЙЛОВИЧ, ГРИНЕВИЧ ІННА ВОЛОДИМИРІВНА (73) ЗАПОРІЗЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, КАМИШНИЙ ОЛЕКСАНДР МИХАЙЛОВИЧ, ГРИНЕВИЧ ІННА ВОЛОДИМИРІВНА 3 ність виявлення Tfh в гістологічних зрізах селезінки і підвищити якість оцінки активності цукрового діабету. Спосіб здійснюють таким чином. Для виявлення поверхневих антигенних детермінант лімфоїдних клітин і кількісної їх оцінки застосовували імунофлюоресцентний метод їх ідентифікації в серійних гістологічних зрізах селезінки, фіксованого в 70 % етанолі з додаванням 0,1 % розчину формаліну. На ротаційному мікроскопі готували серійні зрізи з різних ділянок селезінки товщиною 5 мкм, які потім депарафінірували в ксилолі, проводили регідратацію в низхідних концентраціях етанолу (96 %, 70 %) і тричі по 10 хвилин відмивали в 0,1 М фосфатному буфері ( рН = 7,4). Досліджені 3 морфологічні зони селезінки - лімфоїдний фолікул, періартеріальна лімфоїдна муфта та маргінальна зона. Дослідженню піддавали випадково відібрані зрізи з різних частин селезінки. Клітинний антигенний маркер ICOS виявляли прямим імунофлюоресцентним методом за допомогою кролячих поліклональних антитіл до ICOS, кон'югованих з флюоресцеїном ізотіоціонатом (FITC). Як первинні антитіла використовували кролячі IgG1 до ICOS щура виробництва Santa Cruz Biothech (США), з якими гістологічні зрізи інкубували протягом 18 годин у вологій камері при Т = 4 °C. Після відмивання надлишку первинних антитіл в 0,1 М фосфатному буфері, зрізи інкубували 60 хвилин (Т = 37 °C) з вторинними антитілами в розведенні 1:64. Як вторинні антитіла використовували антитіла до IgG кролика-FITC (Sigma Chemical, США). Після інкубації зрізи промивали 0,1 М фосфатним буфером і укладали в суміш гліцерину і фосфатного буфера (9:1) для подальшої люмінесцентної мікроскопії. Оброблені гістологічні зрізи вивчали на комп'ютерній системі цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина). Зображення, що отримується на мікроскопі AXIOSKOP (ZEISS, Німеччина) в ультрафіолетовому спектрі збудження 390 нм, за допомогою високочутливої відеокамери COHU-4722 (COHU Inc., США) негайно вводилося в комп'ютерну систему цифрового аналізу зображення VIDAS-386. При цьому виключався ефект "вигорання" препарату, пов'язаний з поступовим руйнуванням молекули FITC під впливом тривалого ультрафіолетового опромінення. Введений відеокадр з імунофлюоресценцією оцифровується за денситометричною шкалою з 256 градаціями сірого кольору. У скануючому режимі вводили всі поля зору з кожної з досліджуваних зон селезінки. Аналіз відеокадрів проводився в автоматичному режимі за допомогою пакета прикладних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина). При цьому в автоматичному режимі визначалися області зі статистично значущою флюоресценці 66695 4 єю, характерною для лімфоїдних клітин, активованих ICOS. Обчислювалася площа лімфоїдних клітин, оцінювалася інтенсивність флюоресценції ідентифікованих імунопозитивних клітин і неспецифічна флюоресценція препарату (так званий "фон"). На підставі цих показників обчислювалася інтенсивність експресії відповідних поверхневих антигенів. Отримані дані зіставлялися з результатами класифікаційного аналізу лімфоїдної популяції, що дозволяло ідентифікувати приналежність імунопозитивних лімфоцитів одному з основних класів клітин лімфоїдної популяції селезінки. Це дозволило обчислити абсолютну (кількість клітин на 1 мм площі селезінки) і відносну (%) щільність розподілу різних ICOS позитивних лімфоцитів в досліджуваних зонах селезінки. Приклад. Після фіксації шматочків селезінки щурів в 70% етанолі з додаванням 0,1 % розчину формаліну, їх зневоднюють у висхідній батареї спиртів, отримують парафінові зрізи товщиною 5-6 мкм та виготовляють гістологічні препарати. Клітинний антигенний маркер ICOS виявляли прямим імунофлюоресцентним методом за допомогою кролячих поліклональних антитіл до ICOS, кон'югованих з флюоресцеїном ізотіоціонатом (FITC). Як первинні антитіла використовували кролячі IgG1 до ICOS щура виробництва Santa Cruz Biothech (США). Після відмивання надлишку первинних антитіл в 0,1 М фосфатному буфері, зрізи інкубували 60 хвилин (Т = 37 °C) з вторинними антитілами в розведенні 1:64. Як вторинні антитіла використовували антитіла до IgG кролика-FITC (Sigma Chemical, США). Після інкубації зрізи промивали 0,1 М фосфатним буфером і укладали в суміш гліцерину і фосфатного буфера (9:1) для подальшого люмінесцентного режиму визначали області зі статистично значущою флюоресценцією, характерною для лімфоїдних клітин, імунопозитивних до ICOS. Для них обчислювалася площа, оцінювалася інтенсивність флюоресценції ідентифікованих імунопозитивних клітин і неспецифічна флюоресценція препарату (так званий "фон"). Отримані дані зіставлялися з результатами класифікаційного аналізу, що дозволяло ідентифікувати приналежність імунопозитивних клітин одному з основних класів клітин селезінки. В результаті класифікаційного аналізу ідентифікували ICOS - імунопозитивні 2 + лімфобласти площею (Аrеа) > = 30,0 мкм ; ICOS + великі лімфоцити 30,0 > Аrеа > = 16,0; ICOS се+ редні лімфоцити 16,0 > Аrеа > = 11,0; ICOS малі лімфоцити 11,0 > Аrеа > = 5,0. Це дозволило об2 числити абсолютну (кількість клітин на 1 мм площі селезінки) і відносну (%) щільність розподілу різних ICOS-імунопозитивних лімфоцитів різних класів у досліджуваних зонах селезінки. При цукровому діабеті ICOS-імунопозитивні лімфоцити спостерігаються в лімфоїдному фолікулі, періартеріальній муфті та маргінальній зоні селезінки. 5 Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 66695 6 Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601