Спосіб оцінки цитодеструкції нейтрофілів при патологічному процесі

Реферат: UA 74083 U UA 74083 U 5 10 15 20 25 30 Корисна модель належить до медицини і цитології, зокрема лабораторної діагностики, і може бути використана в експериментальній патології і широкій медичній практиці при проведенні діагностичних досліджень. Відомий спосіб оцінки цитодеструкції нейтрофілів при патологічному процесі, що включає визначення показника їх апоптозу [1]. За відомим способом визначають показник апоптозу нейтрофілів як відображення еволюційно детермінованої функції запрограмованої смерті клітин. Недоліком відомого способу є недостатній рівень інформативності і точності діагностичного дослідження, що випливає із обмеження його даними лише про стан апоптозу як кінцевого етапу адаптації організму до дії несприятливих чинників, перш за все за умов патологічного процесу, тоді як внутрішньоклітинні механізми залишаються поза увагою. В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалити відомий спосіб, в якому шляхом введення додаткових технологічних прийомів дослідження клітинної резистентності, спрямованих на виявлення скритих механізмів цитодеструкції, особливо в аспекті її формування і розвитку в ході патологічного процесу, досягають підвищення інформативності і точності діагностичного дослідження. При вирішенні технічної задачі було взято до уваги те, що ранніми ознаками початку апоптичних змін в клітині є окислення ліпідів клітинних мембран, яке відбувається внаслідок надмірної генерації активних форм кисню у мітохондріях, які модифікують макромолекули ферментних білків і нуклеїнові кислоти, а також фосфоліпідні мембрани цих та інших органел [2]. Пошкоджені мітохондрії стають постійним джерелом різноякісних, часом досить агресивних побічних продуктів порушеного метаболізму і власних компонентів, що, виходячи з органел, негативно впливають на різні внутрішньоклітинні процеси, ініціюючи апоптичні зміни гранулоцитів [3]. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі оцінки цитодеструкції нейтрофілів при патологічному процесі, що включає визначення показника їх апоптозу, відповідно до корисної додатково в нейтрофілах визначають вміст активних форм кисню і кількість нейтрофільних лейкоцитів із зниженим мітохондріальним трансмембранним потенціалом за даними цитофлюорометричного аналізу, причому діагностичний висновок роблять за інтегральним індексом цитодеструкції ( Icd ) як середньої кубічної вказаних показників за допомогою формули: Icd  3   r   , (1) 35 40 45 50 55 де  - показник апоптозу, %; r - показник вмісту активних форм кисню, %;  - число гранулоцитів із зниженим мітохондріальним трансмембранним потенціалом, %. Спосіб здійснюють наступним чином. У лабораторної тварини набирають кров на аналіз: по 0,50 мл до і після відтворення патологічного процесу. Далі за методикою проточної цитофлуорометрії визначають послідовно показники апоптозу  (%), показник вмісту активних форм кисню r (%) і число нейтрофілів із зниженим мітохондріальним трансмембранним потенціалом  (%). Отримані дані заносять у робочу таблицю, після чого, користуючись формулою 1, визначають інтегральний індекс цитодеструкції ( Icd ), за рівнем якого оцінюють цитодеструкцію нейтрофілів при вибраному патологічному процесі. Приклад 1. Статевозрілому щуру-самцю масою 210 г моделюють гостре аспіраційне ураження легень. Експериментальну тварину анестезують внутрішньоочеревинним введенням тіопенталу натрію в дозі 8,4 мг, з розрахунку 40 мг/кг маси щура. Вентральну сторону шиї тварини обробляють хлоргексидином і роблять 0,5 см серединний розріз для візуалізації трахеї. Тварину розміщують горизотально під кутом 45° для правильного відтворення експериментальної моделі, потім інсуліновим шприцом вводять в трахею 0,6 моль/л гідрохлоридної кислоти при рН 1,2 в дозі 0,21 мл, з розрахунку 1,0 мл/кг маси тварини на вдиху. Через 24 год. забирають венозну кров, центрифугують її протягом 10 хв. при 3000 об. З надосадової рідини виділяють фракцію гранулоцитів на двох градієнтах щільності фіколурографіну: щільність верхнього шару - 1,075-1,077, а нижнього - 1,093-1,095. В інтерфазі між двома шарами збирають гранулоцити. Методом проточної цитофлюориметрії визначають показники: рівня апоптозу - 1,18 %, вмісту активних форм кисню - 87,7 % і число нейтрофілів із зниженим мітохондріальним трансмембранним потенціалом - 5,91 %. Розраховують інтегральний індекс цитодеструкції ( Icd ) за допомогою формули 1, що дорівнює Icd  3 1.18  87 .7  5.91  8.49 . 1 UA 74083 U 5 10 Приклад 2. Десятьом білим статевозрілим нелінійним щурам масою 200-220 г моделювали гостре аспіраційне ураження легень інтратрахеальним введенням гідрохлоридної кислоти, рН 1,2 в дозі 1,0 мл/кг на вдиху. Через 2 год. отримали бронхоальвеолярний змив шляхом інтратрахеального введення 2 мл стерильного фізіологічного розчину, який через 1 хв забирали, дану процедуру повторювали тричі. Отриманий бронхоальвеолярний змив центифугували протягом 10 хв при 3000 об. З надосадової рідини виділяли фракцію гранулоцитів. Контрольну групу склали 10 тварин, яким відповідно до моделі вводили інтратрахеально ізотонічний розчин натрію хлориду в еквівалентній дозі. Проточною цитофлюориметрією визначали рівень апоптозу, вміст активних форм кисню і кількість гранулоцитів із зниженим мітохондріальним трансмембранним потенціалом (табл.). Таблиця Рівень цитодеструкції гранулоцитів бронхоальвеолярного змиву у щурів із гострим аспіраційним ураженням легень № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 М±m 15 20 25 Контрольна група Дослідна група r, % r, % Icd , % , % , % , % Icd 0,89 1,85 40,20 4,04 3,98 5,37 80,30 11,97 0,95 1,28 38,70 3,61 3,06 4,93 81,90 10,73 1,22 1,32 39,70 3,98 2,20 6,32 82,20 10,45 0,80 1,75 42,80 3,89 3,60 6,12 79,20 12,04 1,75 1,15 41,40 4,36 4,64 4,56 78,80 11,86 1,54 1,63 36,60 4,50 3,63 6,23 82,50 12,31 1,43 1,53 40,90 4,46 2,35 7,02 80,90 11,00 1,08 1,12 38,40 3,58 3,36 5,72 84,30 11,74 1,43 1,15 38,90 3,98 4,47 4,59 77,60 11,68 1,17 1,71 35,10 4,12 3,82 5,17 85,10 11,89 1,23±0,10 1,45±0,09 39,27±0,72 4,05±0,10 3,51±0,25 5,60±0,26 81,28±0,76 11,57±0,20 У процесі здійснення експериментів встановили, що інтегральний індекс цитодеструкції при експеримнтальному гострому аспіраційному ураженні легень через 2 год. достовірно перевищував (р