Спосіб інгібування активності біоплівок грибів candida albicans

Реферат: UA 74274 U UA 74274 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до області біології і медицини, зокрема стосується способу інгібування активності біоплівок грибів Candida albicans. Більшість бактерій і грибів існує в природних екосистемах не у вигляді вільно плаваючих планктонних клітин, а як специфічно організовані і прикріплені до субстратів біоплівки. Candida albicans є одним з найбільш небезпечних диморфних грибів, патогенних для людини. Гриби C.albicans займають третє місце серед збудників так званих катетероасоційованих інфекцій, і друге місце як причина смертності від них. Стандартна антимікробна терапія зазвичай не призводить до ірадикації біоплівок, що може зумовлювати розвиток хронічних інфекцій та тривалу персистенцію збудника, тому інгібування активності біоплівок грибів Candida albicans є актуальною задачею біології та медицини. Відомо, що для інгібування метаболічної активності у біоплівках необхідна в 30-2000 разів більш висока концентрація антимікотиків, ніж їхня мінімально пригнічуюча концентрація для планктонних клітин. У зв'язку з надзвичайно високою стійкістю біоплівок до антимікробних препаратів, суттєво змінились принципи проведення антимікробної терапії. Нові підходи до лікування інфекцій, що протікають з утворенням біоплівок, включають нові лікарські форми антимікробних препаратів на основі нанотехнологій. Так, наприклад, відомий метод інгібування росту біоплівок грибів Candida albicans антигрибковим препаратом Liposomal amphotericin В (LAMB), отриманим на основі синтетичних ліпідів [Н. FEMS Liposomal amphotericin В eradicates Candida albicans biofilm in a continuous catheter flow model // Yeast Res. 2010 Jun; 10(4):492-5]. В цій роботі було показано, что Candida Albicans можливо знищити ліпосомальним амфотерицином В (LAMB). Після 24-годинного утворення біоплівки та 24-годинної обробки з LAMB ріст біоплівок був знижений на 80 % порівняно з контролем. Для неліпосомальних антигрибкових засобів інгібування біоплівок було зупинено тільки на 20 %. Даний спосіб інгібування активності біоплівок грибів Candida albicans є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю та результатом, який може бути досягнутим. Недоліками цього способу інгібування активності біоплівок грибів Candida albicans є неповне інгібування росту біоплівок, висока вартість LAMB та токсичність амфотерицину В. У зв'язку з вищевикладеним, в основу корисної моделі поставлено задачу підвищення ефективності інгібування активності біоплівок грибів Candida albicans, розширення арсеналу засобів, які можна використовувати для цього. Задачу, яку поставлено в основу корисної моделі вирішують тим, що у відомому способі інгібування активності біоплівок грибів Candida albicans шляхом застосування ліпосомальної форми антимікотиків, згідно з корисною моделлю, для інгібування активності біоплівок грибів Candida albicans як антигрибковий засіб застосовують тербінафін на основі лецитину в органічних розчинах у співвідношенні тербінафін:лецитин 1:5-1:20 з концентрацією ліпідів 1-2 % та розміром ліпосом 160-180 нм. Технічний результат способу, що заявляється, обумовлений обробкою біоплівок грибів Candida albicans ліпосомальним тербінафіном, отриманим на основі лецитину, що сприяє зменшенню їх росту у 8-16 разів порівняно з інтактним тербінафіном. Спосіб здійснюють наступним чином. Субстанцію антимікотика (тербінафін гідрохлорид) розчиняють у хлороформі або ДМСО, змішують з лецитином в співвідношенні антимікотик:лецитин 1:5-1:20, випарюють отриману суміш на вакуумному ротаційному випарювачі з наступним суспендуванням у забуференому фізіологічному розчині (ЗФР) з рН 7,4 для одержання ліпосомальної дисперсії з концентрацією ліпідів 1-2 %, продавлюють на екструдері при охолодженні до 2-4 °C до досягнення розміру ліпосом 160-180 нм. Біоплівки C.albicans одержують культивуванням на середовищі, що містить декстрозу (2 %), 6 пептон (2 %), дріжджовий екстракт (1 %) (середовище ДПДЕ). 10 грибних елементів C.albicans вносять у плоскодонні планшети для імунологічних досліджень і інкубують при 34 °C протягом 48 годин. Біоплівки, що утворюються, 3 рази відмивають стерильним ЗФР. Залишок ЗФР видаляють смужкою фільтрувального паперу. Для визначення мінімальної пригнічуючої концентрації (МПК) тербінафіну препарат розводять методом серійних розведень середовищем ДПДЕ в аналогічних плоскодонних планшетах, додають до біоплівок, інкубують протягом 24 годин. Після цього біоплівки відмивають від препарату і висівають на щільне середовище Сабуро для підрахунку кількості колонієутворюючих одиниць (КУО) і визначення МПК. За МПК вважають найменшу концентрацію, що затримує ріст біоплівок грибів протягом періоду інкубації. Ефективність способу ілюструють наступні приклади: 1 UA 74274 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Приклад 1. 6 мг субстанції антимікотика (тербінафіну гідрохлориду) розчиняли в 1 мл хлороформу, змішували з 30 мг лецитину 1:5, випарювали отриману суміш на вакуумному ротаційному випарювачі (Vakuum-Rotation, Німеччина), суспендували у 3 мл забуференого фізіологічного розчину з рН 7,4 для одержання ліпосомальної дисперсії з концентрацією ліпідів 1 %, продавлювали на екструдері при охолодженні до 2-4 °C до досягнення розміру ліпосом 160 нм. Одержували біоплівки C.albicans. Антигрибковий ліпосомальний препарат розводили методом серійних розведень середовищем ДПДЕ в аналогічних плоскодонних планшетах, додавали по 100 мкл до біоплівок, інкубували протягом 24 годин. Після цього біоплівки відмивали від препарату і висівали на щільне середовище Сабуро для підрахунку кількості КУО і визначення МПК за МПК вважали найменшу концентрацію, що затримує ріст біоплівок грибів протягом періоду інкубації. МПК ліпосомального тербінафіну складала 82 мкг/мл, у 3 рази менше МПК водного розчину тербінафіну. Приклад 2. 3 мг субстанції антимікотика (тербінафіну гідрохлориду) розчиняли в 1 мл хлороформу, змішували з 30 мг лецитину 1:10, випарювали отриману суміш на вакуумному ротаційному випарювачі (Vakuum-Rotation, Німеччина), суспендували у 3 мл ЗФР з рН 7,4 для одержання ліпосомальної дисперсії з концентрацією ліпідів 1 %, продавлювали на екструдері при охолодженні до 2-4 °C до досягнення розміру ліпосом 160 нм. Одержували біоплівки C.albicans. Антигрибковий ліпосомальний препарат розводили методом серійних розведень середовищем ДПДЕ в аналогічних плоскодонних планшетах, додавали по 100 мкл до біоплівок, інкубували протягом 24 годин. Після цього біоплівки відмивали від препарату і висівали на щільне середовище Сабуро для підрахунку кількості КУО і визначення МПК за МПК вважали найменшу концентрацію, що затримує ріст біоплівок грибів протягом періоду інкубації. МПК ліпосомального тербінафіну складала 64 мкг/мл, у 4 рази менше МПК водного розчину тербінафіну. Приклад 3. 3 мг субстанції антимікотика (тербінафіну гідрохлориду) розчиняли в 1 мл хлороформу, змішували з 60 мг лецитину 1:5, випарювали отриману суміш на вакуумному ротаційному випарювачі (Vakuum-Rotation, Німеччина), суспендували у 3 мл ЗФР з рН 7,4 для одержання ліпосомальної дисперсії з концентрацією ліпідів 2 %, продавлювали на екструдері при охолодженні до 2-4 °C до досягнення розміру ліпосом 160 нм. Одержували біоплівки C.albicans. Антигрибковий ліпосомальний препарат розводили методом серійних розведень середовищем ДПДЕ в аналогічних плоскодонних планшетах, додавали по 100 мкл до біоплівок, інкубували протягом 24 годин. Після цього біоплівки відмивали від препарату і висівали на щільне середовище Сабуро для підрахунку кількості КУО і визначення МПК За МПК вважали найменшу концентрацію, що затримує ріст біоплівок грибів протягом періоду інкубації. МПК ліпосомального тербінафіну складала 32 мкг/мл, у 8 разів менше МПК водного розчину тербінафіну. Приклад 4. 6 мг субстанції антимікотика (тербінафіну гідрохлориду) розчиняли в 1 мл хлороформу, змішували з 60 мг лецитину 1:5, випарювали отриману суміш на вакуумному ротаційному випарювачі (Vakuum-Rotation, Німеччина), суспендували у 3 мл ЗФР з рН 7,4 для одержання ліпосомальної дисперсії з концентрацією ліпідів 1 %, продавлювали на екструдері при охолодженні до 2-4 °C до досягнення розміру ліпосом 160 нм. Одержували біоплівки C.albicans. Антигрибковий ліпосомальний препарат розводили методом серійних розведень середовищем ДПДЕ в аналогічних плоскодонних планшетах, додавали по 100 мкл до біоплівок, інкубували протягом 24 годин. Після цього біоплівки відмивали від препарату і висівали на щільне середовище Сабуро для підрахунку кількості КУО і визначення МПК За МПК вважали найменшу концентрацію, що затримує ріст біоплівок грибів протягом періоду інкубації. МПК ліпосомального тербінафіну складала 16 мкг/мл, у 16 разів менше МПК водного розчину тербінафіну. 2 UA 74274 U Таблиця 1 № п/п Препарат 1. 2. 3. 1 % ліпосоми (тербінафін:лецитин у співвідношенні 1:5) 1 % ліпосоми (тербінафін:лецитин у співвідношенні 1:100) 2 % ліпосоми (тербінафін:лецитин у співвідношенні 1:20) 2 % ліпосоми (тербінафін:лецитин у співвідношенні 1:10) фарнезол (100 μМ) 4. МПК мкг/мл 82 64 32 5. тербінафін, водний розчин Контроль 6. фарнезол (100 μМ) Контроль 5 32 256 0 Таким чином, таблиця ілюструє позитивний ефект способу інгібування росту біоплівок Candida albicans за допомогою ліпосомального антимікотика тербінафіну, інгібуючий ефект якого у 8-16 разів більший порівняно з інтактним тербінафіном, що дозволить зменшити токсичність та терапевтичні дози засобу. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Спосіб інгібування активності біоплівок грибів Candida albicans шляхом застосування ліпосомальної форми антимікотиків, який відрізняється тим, що для інгібування активності біоплівок грибів Candida albicans як антигрибковий засіб застосовують тербінафін на основі лецитину в органічних розчинах у співвідношенні тербінафін:лецитин 1:5-1:20 з концентрацією ліпідів 1-2 % та розміром ліпосом 160-180 нм. 15 Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3