Спосіб культивування калусної культури материнки звичайної (origanum vulgare l.)

Реферат: UA 74275 U UA 74275 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до області біотехнології, а саме до способу отримання калусної культури материнки звичайної (Origanum vulgare L.), яка може бути використана як сировина для одержання біологічно активних речовин (тритерпенових сапонінів, дубильних речовин, флавоноїдів, антоціанів) з перспективою використання їх в фармацевтичній, харчовій та медичній промисловості. Материнка є однією з лікарських рослин, що використовуються як у народній, так й практичній науковій медицині як відхаркувальний, антисептичний, загальнозміцнюючий, діуретичний, протизапальний та протисудомний засіб. Відомо, що використання замість інтактних рослин їх клітинних культур, отриманих біотехнологічними методами, має ряд переваг: зменшення антропогенного впливу на дику природу, можливість одержання біомаси, яка не містить полютантів (гербіцидів, пестицидів, важких металів тощо), можливість керування процесом біосинтезу цільових продуктів і т. д. В сучасній біотехнології відомі способи одержання біомаси калусних тканин багатьох лікарських рослин - продуцентів біологічно активних речовин: ломиносу, женьшеню, діоскореї, юки, княжика сибірського, гінкго дволопатевого, плюща. Найбільш близьким за технічною суттю є спосіб одержання калусної тканини ломиносу виноградолистого, що включає виділення експланта, його стерилізацію та культивування на модифікованому живильному середовищі Мурасіге і Скуга, зняття біомаси, збереження частини 6 її для подальшого культивування [Патент України № 18328, МПК С12N5/04. Спосіб культивування калусної культури ломиносу виноградолистого (Clematis vitalba L.) / Чмельова С.І., Бугара О.М., Сідякін А.Л., Юркова І.М. Заявл. - 29.03.2006. - Опубл. - 15.11.2006. - Бюл. № 11]. Задачею корисної моделі є розширення класу лікарських рослин, для яких розроблені способи одержання біомаси калусних тканин - створення способу одержання та культивування калусної тканини материнки звичайної (Origanum vulgare L.). Поставлена задача вирішується завдяки тому, що в запропонованому способі культивування калусної культури материнки звичайної (Origanum vulgare L.), що включає виділення експланта, його стерилізацію та культивування на живильному середовищі Мурасіге і Скуга, попередньо, на безгормональному живильному середовищі Мурасіге і Скуга, отримують асептичні паростки, які потім культивують на живильному середовищі Мурасіге і Скуга, модифікованому для ініціації калусоутворення фітогормонами у концентраціях: 2,4дихлорфеноксіоцтової кислоти (2,4-Д) - 0,1-0,3 мг/л та 6-бензиламінопурину (БАП) - 0,01-0,03 мг/л. Приклади конкретного виконання: Приклад 1. Готують живильне середовище, яке містить мінеральні солі та мікроелементи за прописом Мурасіге і Скуга (Murashige Т. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Phisiol. plant. - 1962. - Bd. 15, № 13. - P. 473-497.), сахарози 20 г/л, нікотинової кислоти - 1,0, тіаміну-НСl 1,0, піридоксину-НСl - 0,5, аскорбінової кислоти 10,0, гліцину - 2,0, агару - 7,0 г/л, розливають в культуральні посудини (склянки В-2-100 ТС ГОСТ 25336-82, В-2-150 ТС ГОСТ 25336-82), по 30-40 мл живильного середовища, закривають ковпачками з алюмінієвої фольги, стерилізують в автоклаві при 121 °C протягом 20-30 хвилин, рН середовища перед автоклавуванням 6,0-6,2. На поверхню застиглого середовища в стерильних умовах висаджують попередньо простерилізоване 1 % розчином KМnО4 (40 хвилин) та сумішшю (1:1) 30 % пергідролю й 96 % етанолу (2-5 хвилин) насіння материнки. Насіння культивують при 26 ± 1 °C в умовах освітлення протягом 14-21 доби для отримання паростків. Після появи першої пари справжнього листя в асептичних умовах паростки виймають з посудин та висаджують для індукції калусоутворення на стерильне живильне середовище, що містить мінеральні солі та мікроелементи за прописом Мурасіге і Скуга, сахарози - 20 г/л, нікотинової кислоти - 1,0, тіаміну-НСl - 1,0, піридоксину-НСl - 0,5, аскорбінової кислоти - 10,0, гліцину - 2,0, 2,4-Д -0,1 мг/л та БАП - 0,01 мг/л, агару - 7,0 г/л. Після культивування протягом 50-65 діб в темряві калус виймають із посудин, відокремлюють від експланта та зважують. Частота калусоутворення при цьому складає 55-65 %. Приклад 2. Готують живильне середовище, яке містить мінеральні солі, та мікроелементи за прописом Мурасіге і Скуга (Murashige Т. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Phisiol. plant. - 1962. - Bd. 15, № 13. - P. 473-497.), сахарози 20 г/л, нікотинової кислоти - 1,0, тіаміну-НСl - 1,0, піридоксину-НСl - 0,5, аскорбінової кислоти 10,0, гліцину - 2,0, агару - 7,0 г/л, розливають в культуральні посудини (склянки В-2-100 ТС ГОСТ 25336-82, В-2-150 ТС ГОСТ 25336-82), по 30-40 мл живильного середовища, закривають 1 UA 74275 U 5 10 15 20 25 30 ковпачками з алюмінієвої фольги, стерилізують в автоклаві при 121 °C протягом 20-30 хвилин, рН середовища перед автоклавуванням 6,0-6,2. На поверхню застиглого середовища в стерильних умовах висаджують попередньо простерилізоване 1 % розчином KМnО4 (40 хвилин) та сумішшю (1:1) 30 % пергідролю й 96 % етанолу (2-5 хвилин) насіння материнки. Насіння культивують при 26 ± 1 °C в умовах освітлення протягом 14-21 доби для отримання паростків. Після появи першої пари справжнього листя в асептичних умовах паростки виймають з посудин та висаджують для індукції калюсоутворення на стерильне поживне середовище, що містить мінеральні солі, та мікроелементи за прописом Мурасіге і Скуга, сахарози 20 г/л, нікотинової кислоти - 1,0, тіаміну-НСl - 1,0, піридоксину-НСl - 0,5, аскорбінової кислоти - 10,0, гліцину 2,0, 2,4-Д - 0,2 мг/л та БАП - 0,02 мг/л, агару - 7,0 г/л. Після культивування протягом 50-65 діб в темряві калус виймають із посудин, відокремлюють від експланта та зважують. Частота калусоутворення складає 60-65 %. Приклад 3. Готують живильне середовище, яке містить мінеральні солі, та мікроелементи за прописом Мурасіге і Скуга (Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Phisiol. plant. - 1962. - Bd. 15, № 13. - P. 473-497.), сахарози 20 г/л, нікотинової кислоти - 1,0, тіаміну-НСl - 1,0, піридоксину-НСl - 0,5, аскорбінової кислоти 10,0, гліцину 2,0, агару - 7,0 г/л, розливають в культуральні посудини (склянки В-2-100 ТС ГОСТ 25336-82, В-2-150 ТС ГОСТ 25336-82), по 30-40 мл живильного середовища, закривають ковпачками з алюмінієвої фольги, стерилізують в автоклаві при 121 °C протягом 20-30 хвилин, рН середовища перед автоклавуванням 6,0-6,2. На поверхню застиглого середовища в стерильних умовах висаджують попередньо простерилізоване 1 % розчином KМnО4 (40 хвилин) та сумішшю (1:1) 30 % пергідролю й 96 % етанолу (2-5 хвилин) насіння материнки. Насіння культивують при 26 ± 1 °C в умовах освітлення протягом 14-21 доби для отримання паростків. Після появи першої пари справжнього листя в асептичних умовах паростки виймають з посудин та висаджують для індукції калусоутворення на стерильне поживне середовище, що містить мінеральні солі, та мікроелементи за прописом Мурасіге і Скуга, сахарози - 20 г/л, нікотинової кислоти - 1,0, тіаміну-НСl - 1,0, піридоксину-НСl - 0,5, аскорбінової кислоти - 10,0, гліцину - 2,0, 2,4-Д - 0,3 мг/л та БАП - 0,03 мг/л, агару - 7,0 г/л. Після культивування протягом 50-65 діб в темряві калус виймають із посудин, відокремлюють від експланта та зважують. Частота калусоутворення складає 70-75 %. Таким чином, наведені приклади демонструють переваги пропонованого способу, що виражається у збільшені ростового індексу в 8-10 разів порівняно з вже відомими способами культивування. 35 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 45 Спосіб культивування калусної культури материнки звичайної (Origanum vulgare L.), що включає виділення експланта, його стерилізацію та культивування на живильному середовищі Мурасіге і Скуга, який відрізняється тим, що як експланти використовують насіння материнки звичайної (Origanum vulgare L.), попередньо здійснюють культивування на безгормональному живильному середовищі Мурасіге і Скуга і отримують асептичні паростки, які потім культивують на живильному середовищі Мурасіге і Скуга, модифікованому для ініціації калусоутворення фітогормонами у концентраціях: 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти - 0,1-0,3 мг/л і 6бензиламінопурину - 0,01-0,03 мг/л. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2