Спосіб прогнозування відповіді на терапію іматинібом у хворих на хронічну мієлоїдну лейкемію на основі визначення типу транскрипту гена bcr/abl р210

Реферат: Спосіб прогнозування відповіді на терапію іматинібом у хворих на хронічну мієлоїдну лейкемію включає визначення хромосомної транслокації t(9;22) та аналіз типу транскрипту химерного гена BCR/ABL р210. При виявленні транскрипту b2а2 прогнозують високу вірогідність досягнення повної цитогенетичної відповіді, а при виявленні транскрипту b3а2 - низьку. UA 75839 U (12) UA 75839 U UA 75839 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до гематології, і може бути використана для прогнозування ефективності лікування іматинібом та перебігу захворювання у хворих на хронічну мієлоїдну лейкемію (ХМЛ) за типом транскрипту гена BCR/ABL p210 та кількістю клітин кісткового мозку з транслокацією t(9;22). На сьогодні існує певна кількість показників, які мають прогностичне значення щодо перебігу ХМЛ. Найбільш розповсюджена прогностична модель базується на визначенні індексу Сокаля, де враховуються вік хворого на час встановлення діагнозу, розміри селезінки, число тромбоцитів і число бластних клітин у крові [1]. При індексі Сокаля (IС) менше 0,8 прогноз сприятливий, медіана тривалості життя складає 60 міс. При IС 1,2 і більше прогноз несприятливий і медіана тривалості життя складає 32 міс. При індексі від 0,9 до 1,1 прогноз проміжний. Недоліком способу є недостатня інформативність в зв'язку з неможливістю визначення точних величин розмірів паренхіматозних органів черевної порожнини, а також відсутністю врахування особливостей генетичних порушень, які є основною патогенетичною подією при ХМЛ. На час розробки даної моделі результати тривалості життя враховували без лікування пацієнтів інгібіторами тирозинкіназ. Застосування способу визначення додаткових хромосомних порушень значно підвищує прогностичний рівень диференційної діагностики ХМЛ. Наявність додаткових хромосомних порушень в каріотипі хворих на ХМЛ асоціюється із скороченням терміну виживання без прогресії захворювання та загального виживання, тобто є чинником несприятливого перебігу захворювання [2]. Однак додаткові хромосомні аномалії виявляються тільки у 5-10 % пацієнтів на етапі діагностики. Більшість пацієнтів, що знаходяться у хронічній фазі захворювання, мають тільки специфічну транслокацію t(9;22). Недоліком цього способу є також довготривалість виконання методики, необхідність використання високовартісних реактивів і спеціального обладнання, а також наявність висококваліфікованого персоналу. Існує спосіб визначення прогнозу перебігу ХМЛ за профайлом генної експресії, який заснований на виявленні специфічної регуляції генів у клітинах хворих на ХМЛ. Для оцінки відповіді на терапію аналізується патерн з декількох сотень генів [3]. Недоліком цього способу є необхідність у наявності високовартісного програмного та комп'ютерного забезпечення. Найбільш близьким до суті є спосіб прогнозування відповіді на терапію на основі аналізу динаміки кількості клітин кісткового мозку з транслокацією t(9;22) на різних етапах лікування інгібіторами тирозинкіназ. Вказаний спосіб прийнято за найближчий аналог. Згідно з цим способом, зниження рівня клітин кісткового мозку з транслокацією t(9;22) до 35 % (велика цитогенетична відповідь) та менше є оптимальною відповіддю на 6 місяців лікування іматинібом та прогнозує отримання більш вірогідної повної цитогенетичної відповіді (редукцію пухлинних клітин із транслокацією t(9;22) до 0 %) протягом 12 місяців терапії іматинібом [4]. Але наведений спосіб є недостатньо інформативним. За даними досліджень, проведених у ДУ "ННЦРМ ΗАМН України", близько 30 % хворих, які мали велику цитогенетичну відповідь через 6 місяців лікування, не досягають повної цитогенетичної відповіді до 12 місяців лікування. Задачею корисної моделі є розробка способу прогнозування відповіді на терапію іматинібом у хворих на хронічну мієлоїдну лейкемію на основі визначення типу транскрипту гена BCR/ABL p210. Поставлена задача вирішується за рахунок аналізу типу транскрипту гена BCR/ABL р210 за допомогою методу зворотньотранскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР) у хворих на хронічну мієлоїдну лейкемію, які через 6 місяців терапії досягли великої цитогенетичної відповіді (рівень метафаз з транслокацією t(9;22) більше 0 %, але не перевищує 35 %). У випадку виявлення транскрипту b2а2 прогнозують високу вірогідність досягнення повної цитогенетичної відповіді через наступні 6 місяців лікування (сприятливий перебіг захворювання), а при наявності транскрипту b3а2 - низьку вірогідність досягнення повної цитогенетичної відповіді через наступні 6 місяців лікування (несприятливий перебіг захворювання). Експресію химерного гену та визначення типу транскрипту BCR/ABL p210 досліджують у зразках кісткового мозку та периферичної крові хворих на ХМЛ методом ЗТ-ПЛР. Вилучення РНК з клітин кісткового мозку та периферичної крові проводять з використанням гуанідинтіоціанату, фенолу та хлороформу за загальною методикою Хомчинського [5, 6]. Преципітацію РНК проводять ізопропанолом протягом 18 годин при -70 °C. Розчинюють РНК в деіонізованій воді з додаванням діетилпірокарбонату (1 мл/л). Для синтезу комплементарної ДНК (кДНК) (зворотної транскрипції) використовують гексамерні праймери та M-MuLV ревертазу ("Fermentas", Латвія) [7]. Режими інкубації витримують згідно з рекомендаціями фірми-виробника набору для зворотної транскрипції. Контроль отриманої кДНК здійснюють шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з 1 UA 75839 U 5 праймерами до гена актину. Зразки кДНК, які є негативними у контрольному ПЛР-тесті, виключають з подальшого аналізу [7]. Визначення експресії химерного гена BCR/ABL p210 проводять за допомогою двораундової "гніздової" ЗТ-ПЛР. Праймери для ампліфікації генів BCR/ABL відповідають протоколам, рекомендованим Європейською програмою BIOMED-1 "Дослідження мінімальної резидуальної хвороби при гострих лейкеміях: міжнародна стандартизація та клінічна оцінка" (табл. 1) [8]. Таблиця 1 Праймери для аналізу химерних генів BCR/ABL Химерний ген BCR/ABL р210 10 15 20 Код праймера BCR-b1-A ABL-а3-В BCR-b2-C ABL-a3-D Послідовність 5'-3' GAA GTG ТТТ CAG AAG СТТ СТС С GTT GGG СТТ САС АСС ATT CC CAG ATG CTG АСС AAC TCG TGT ТТС ССС CAT TGT GAT TAT AGC СТА ПЛР-суміш складається за стандартним протоколом [8]. Кінцевий об'єм суміші для ампліфікації - 25 мкл. Ампліфікацію проводять на термоциклерах GeneAMP PCR System 2700 ("Applied Biosystems", США) та UNO II ("Biometra", Німеччина). Проводять два раунда ПЛР: перший раунд із зовнішніми праймерами (А та В) та другий раунд із внутрішніми праймерами (С та D). Два мкл продукту, отриманого в першому раунді, використовують як матрицю для другого раунда. Режими ампліфікації в обох раундах відповідають наведеним у протоколах BIOMED-1 [8]. Після початкової денатурації при 94 °C, 2 хв проводять 35 циклів денатурації - 94 °C, 30 с, відпалу - 65 °C, 60 с та елонгації - 72 °C, 60 с. Отриманий ПЛР-продукт візуалізують методом електрофорезу у 2 % агарозному гелі із забарвленням бромистим етидієм. Позитивним контролем є контролі, синтезовані у Гематологічному науковому центрі РАМН (Москва), а також кДНК хворих, у яких було виявлено раніше експресію відповідних химерних генів. Негативним контролем є ПЛР-суміш без кДНК-матриці. Розмір ПЛР-продуктів після першого та другого раундів ампліфікації при використанні вказаних праймерів для генів BCR/ABL, наведений у табл. 2. Таблиця 2 Розмір ПЛР-продуктів при використанні для ампліфікації гена BCR/ABL праймерів, синтезованих за протоколами BIOMED-1 [8] Химерний ген BCR/ABL p210 25 30 35 40 Назва транскрипту р210b3-а2 р210b2-а2 Розмір продукту, п.о. 1-й раунд 2-й раунд С↔D A↔B 417 360 342 285 Результат ЗТ-ПЛР вважають позитивним, коли продукт ампліфікації присутній в кістковому мозку та периферійній крові, або позитивний результат повторюється в декількох зразках матеріалу, що отриманий від одного й того ж хворого. Для вирішення поставленої задачі, яка полягає у прогнозуванні перебігу ХМЛ та відповіді на терапію іматинібом, оцінювали тип транскрипту химерного гена BCR/ABL р210 у хворих, які досягли великої цитогенетичної відповіді через 6 місяців лікування. Прогностична ефективність способу була статистично підтверджена на групі хворих з позитивною відповіддю на лікування (21 пацієнт), та негативною відповіддю на лікування - 22 пацієнта з ХМЛ. Термін спостереження складав 12 місяців. Пацієнти із сприятливим прогнозом перебігу захворювання (позитивною відповіддю на лікування) досягали повної цитогенетичної відповіді до 12-го місяця лікування. Хворі із несприятливим прогнозом перебігу захворювання не досягали повної цитогенетичної відповіді 12-го місяця лікування (у них продовжував зберігатися клон клітин з транслокацією t(9;22). Таким чином, зазначений спосіб може бути використаний для оцінки прогнозу відповіді на терапію іматинібом та подальшої індивідуалізації підходів до лікування. Приклади результатів дослідження: 2 UA 75839 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Приклад 1. Хвора У.Л., 1958 p. народження. Історія хвороби № 769/54. Діагноз ХМЛ був встановлений в 2008 р. При обстеженні у пацієнтки був виявлений b2а2 транскрипт химерного гена BCR/ABL р210. Через 6 місяців лікування іматинібом рівень клітин з Ph-хромосомою з 100 % знизився до 15 %, а на 12-й місяць дорівнював 0 %. Прогноз перебігу захворювання у даної пацієнтки сприятливий. Приклад 2. Хворий М.С., 1979 р. народження. Історія хвороби № 3369. Діагноз ХМЛ встановлений в 2009 р. При первинному обстеженні виявлений b2а2 транскрипт химерного гена BCR/ABL p210. Лікування іматинібом через 6 місяців привело до зниження числа клітин з Ph-хромосомою з 95 % до 25 %, а на 12-й місяць дорівнював 0 %. Прогноз перебігу захворювання у даного пацієнта оцінюється як сприятливий. Приклад 3. Хворий Щ.О., 1962 року народження. Історія хвороби № 2143. Діагноз ХМЛ встановлений в 2009 р. При первинному обстеженні виявлений b3а2 транскрипт химерного гена BCR/ABL р210. Лікування іматинібом через 6 місяців привело до зниження числа клітин з Ph-хромосомою з 95 % до 30 %, а на 12-й місяць дорівнював 10 %. Прогноз перебігу захворювання у даному випадку оцінюється як несприятливий. Джерела інформації:: 1. Socal J.E., Сох Е.В., Baccarani М. et al. Prognostic discrimination in "good-risk" chronic granulocytic leukemia // Blood.-1984. - Vol. 63. - P. 789-799. 2. Marin D., Milojkovic D., Olavamia Ε., et al; European LeukemiaNet criteria for failure or suboptimal response reliably identify patients with CML in early chronic phase treated with imatinib whose eventual outcome is poor//Blood-2008. - Vol. 112. - P. 4437-4444. 3. Radich J., Dai H., Mao Μ et al. Genes associate with progression and response in chronic myeloid leukemia and uses thereof. Патент US 2007/0154931 A1. 4. Kantarjian H, O'Brien S, Shan J, et al. Cytogenetic and molecular responses and outcome in chronic myelogenous leukemia: need for new response definitions. - Cancer. 2008; 112(4): 837-845. 5. Chomczinski, P.N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanatephenol-chloroform extraction / Chomczinski P., Sacchi N. // Analyt. Biochem.-1987. - Vol. 162-P. 156159. 6. Виділення нуклеїнових кислот з клінічного матеріалу: метод, рекомендації / КМАПО ім. П.Л. Шупіка МОЗ України. - К., 2010.-39 с. 7. Harmonization of molecular monitoring of CML therapy in Europe / Muller M.C. [et al] // Leukemia.-2009. Vol.: 23. - P. 1957-1963. 8. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease / J.M. van Dongen [et al] // Leukemia.-1999. Vol. 13. - P. 1901-1928. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб прогнозування відповіді на терапію іматинібом у хворих на хронічну мієлоїдну лейкемію, який включає визначення хромосомної транслокації t(9;22), який відрізняється тим, що аналізується тип транскрипту химерного гена BCR/ABL р210 та при виявленні транскрипту b2а2 прогнозують високу вірогідність досягнення повної цитогенетичної відповіді, а при виявленні транскрипту b3а2 прогнозують низьку вірогідність досягнення повної цитогенетичної відповіді через наступні 6 місяців лікування (несприятливий перебіг захворювання). Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3