Спосіб клонального мікророзмноження сорго цукрового

Реферат: Спосіб клонального мікророзмноження сорго цукрового включає стерилізацію насіння сорго цукрового, використання для розмноження та укорінення модифікованого середовища за прописом Мурасіге і Скуга. Для стерилізації насіння використовують розчин Білизни, для розмноження у середовище Мурасіге і Скуга додають БАП, кінетин, цукрозу, для укорінення у середовище Мурасіге і Скуга додають ІОК і НОК і цукрозу. Культивування проводять при 16 годинному фотоперіоді при температурі 24±2 °C з інтенсивністю освітлення 4000-4500 лк, відносній вологості 70-80 %. UA 76600 U (54) СПОСІБ КЛОНАЛЬНОГО МІКРОРОЗМНОЖЕННЯ СОРГО ЦУКРОВОГО UA 76600 U UA 76600 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології, селекції, рослинництві, зокрема для розмноження і отримання розсади цінних селекційних матеріалів та збереження генотипу вихідної форми. Сорго (Sorghum)- рід одно- та багаторічних рослин родини тонконогових (Роасеае), що охоплює до 50 дикоростучих і культурних видів, поширених переважно у тропічних і субтропічних країнах, з яких кілька видів культивуються людиною. Особливе значення представляють гібриди і сорти з підвищеним вмістом цукрі, які об'єднані в групу "цукрове сорго". Це високорослі (до 3-3,5 м) рослини, здатні до кінця вегетації (з одно га можна збирати 90-100 тон зеленої маси) накопичувати у сирих стеблах до 17 % цукру, а в соку стебел до 17-24 % цукру. Вихід соку з зеленої маси становить 70-85 %, середній вихід цукру - 17 т/га. З виробленого цукру за подальшої переробки можна отримати етилового спирту кількістю 12,2 т, з якого можна виготовити 8,0 тонн біобензину. Основне призначення цукрового сорго є виробництво кормів для тваринництва (на зелений корм, силос, борошно, гранули). Для отримання високих урожаїв біомаси в Україні важливе використання сучасних гібридів цукрового сорго. Сьогодні вирощують гетерозисні гібриди сорго, які мають вищу продуктивність порівняно із сортами. Однак сорго є перехреснозапильна культура і створення гібридів вимагає довготривалого періоду. Використання біотехнологічних методів у селекції дозволяє значно прискорити створення нових вихідних матеріалів для лінійної селекції цукрового сорго, які б мали комплекс господарсько-цінних ознак. Тому одним із важливих питань є введення та розмноження рослинного матеріалу у культурі in vitro. Відомим і найбільш близьким до корисної моделі є культивування меристем гібридів сорго (An efficient protocol for culturing of sorghum hybrids Sadia B, PC Josekutty, SD Potlakayala, P Patel, S Goldman, SV Rudrabhatla// ФОТОN 79 2010 P 177-181). Даний метод базується на тому, що насіння гібридів сорго (NC+6 С21, NC+262 і NC+6 В50) було використане для стерилізації. Їх промивали дистильованою водою, потім стерилізували 70 % розчином етанолу протягом однієї хвилини і пересаджували на середовище Мурасіге і Скуга та проводили інкубування в темряві протягом трьох діб при температурі 24±2° С. В подальшому стерильні і життєздатні експлантатати переносили на модифіковане живильне середовище Мурасіге і Скуга з додаванням 6-Бензиламінопурину БАП - 3 мг/л та ТДЗ - 1 мг/л, 20 г/л цукрози та після третього пасажу отримали 5 штук нових пагонів. Отримані від розмноження пагони пересаджують на середовище Мурасіге і Скуга, яке доповнене 20 г/л цукрозою та, на 21 добу, одержують 80 % укорінених рослин сорго. Відомий і пропонований способи клонального мікророзмноження мають спільні ознаки: стерилізація насіння і отримання життєздатних стерильних експлантатів, живильні середовища за прописом Мурасіге і Скуга для розмноження та укорінення, пересадка укорінених рослин у ґрунт. Проте, відомий спосіб розмноження сорго є доволі трудомістким, так як включає інкубування у темряві експлантатів, не забезпечує отримання достатньої кількості стерильних та життєздатних експлантатів, а також не дає високого коефіцієнту розмноження рослин і потребує довшого терміну культивування. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб клонального мікророзмноження сорго цукрового, що дасть можливість отримати 92 % стерильних та 86 % життєздатних експлантатів, зменшити затрати та удосконалити склад живильних середовищ для розмноження та укорінення додаючи БАП- 0,2-0,5 мг/л, кінетин - 0,8-1,2 мг/л, ІОК (індолілоцтову) і НОК (нафтилоцтову) кислоту -0,6-0,8 мг/л, цукрозу - 30,0 г/л, збільшити коефіцієнт розмноження, зменшити термін культивування рослин та пришвидшити отримання розсади, яку можна пересаджувати у ґрунт. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі культивування меристем гібридів сорго використовують насіння гібридів, яке промивають дистильованою водою, стерилізують 70 % розчином етанолу протягом 60 хвилини і пересаджують на середовище за прописом Мурасіге і Скуга та проводять інкубування в темряві протягом трьох діб за температури 24±2° С та 16 годинному фотоперіоді. Стерильні і життєздатні експлантати переносять на модифіковане живильне середовище Мурасіге і Скуга з додаванням 6Бензиламінопурину БАП - 3 мг/л та ТДЗ (тідіазурон)- 1 мг/л, 20 г/л цукрози, що забезпечує отримання 5 штук нових пагонів. Рослини пересаджують на середовище Мурасіге і Скуга в яке включено додатково 20 г/л цукрози. Придатність рослин до пересаджування у ґрунт можлива на 21 добу. Запропонований спосіб клонального мікророзмноження сорго цукрового включає використання насіння, яке промивають дистильованою водою, стерилізацію проводять 35 % розчином Білизни, експозицією 45 хвилин, що забезпечує отримання 92 % стерильних та 86 % 1 UA 76600 U 5 10 15 20 25 30 35 життєздатних експлантатів. Пересаджують проростки на модифіковане живильне середовище Мурасіге і Скуга, що доповнене БАП- 0,2-0,5 мг/л, кінетином - 0,8-1,2 мг/л та 30,0 г/л цукрозою. Для укорінення було введено модифікацію із додаванням ІОК і НОК- 0,6-0,8 мг/л, цукрози - 30,0 г/л. Культивування проводили при температурі 24±2 °C та довжині фотоперіоду 16 годин, що забезпечує отримання 12-14 додаткових пагонів. Новими відмінними від прототипу ознаками є: - використання стерилізатора Білизна - 35 %; - експозиція 45 хвилин; - додавання у середовище для розмноження БАП - 0,2-0,5 мг/л, кінетину - 0,8-1,2 мг/л та цукрози 30 г/л; - використання цукрози; - для укорінення рослин додавання НОК і ІОК 0,6-0,8 мг/л, цукрози 30 г/л; - пересаджування рослин у ґрунт на 14 добу. Відмінні від прототипу ознаки при взаємодії з відомими дозволяють отримати високий вихід стерильних та життєздатних експлантатів, здешевити та удосконалити склад живильного середовища, зменшити додатковий етап інкубування у темряві експлантатів, пришвидшити отримання розсади та збільшити коефіцієнт розмноження сорго. Ефективність нового способу клонального мікророзмноження сорго цукрового у культурі in vitro вивчали на таких матеріалах: Медовий, К 79А+2333, К 88+1960, OP 128A. Згідно отриманих результатів досліджень видно, що заміна стерилізуючої речовини та експозиції дає можливість отримати 92 % стерильних та 86 % життєздатних експлантатів. Етанол 70 %, проникаючи у насіння, пригнічує ростові процеси, хоча і дозволяє одержати 67 % стерильної культури. Результати досліджень свідчать, що можна знехтувати додатковим етапом індукування у темряві експлантатів. Крім того, зменшення БАП до 0,2-0,5 мг/л та поєднання із кінетином 0,8-1,2 мг/л і цукрозою -30,0 г/л забезпечує утворення 12-14 додаткових пагонів. Видалення при розмноженні ТДЗ, який здебільшого використовують для деревовидних видів, дозволило уникнути морфологічних порушень та зменшити собівартість середовища. Модифікація НОК і ІОК 0,6-0,8 мг/л, цукрози 30 г/л у середовищі для укорінення забезпечує 97 % укорінених рослин на 14 добу. Спосіб клонального мікророзмноження сорго цукрового здійснюється таким чином: за вихідний експлантат використовують насіння сорго цукрового, яке промивають у дистильованій воді. В подальшому проводять поверхневу стерилізацію 35 % розчином Білизна експозицією 45 хвилин, що забезпечує отримання 92 % стерильних та 86 % життєздатних експлантатів. Пересаджування рослин на модифіковане живильне середовище Мурасіге і Скуга з додаванням БАП до 0,2-0,5 мг/л, кінетину 0,8-1,2 мг/л, цукрози - 30,0 г/л, дає змогу отримати 12-14 додаткових пагонів. Клоновані рослини культивують в термальних приміщеннях при температурі 24±2 °C, освітленні 3000-4000 лк, відносній вологості 65-70 % та фотоперіоді - 16 годин. Для укорінення готують модифіковане середовище за прописом Мурасіге і Скуга із НОК і ІОК 0,6-0,8 мг/л, цукрозою 30 г/л, що забезпечує 97 % укорінених рослин на 14 добу. 40 Таблиця 1 Показники ефективності використання запропонованого способу розмноження сорго цукрового Відомий спосіб Етанол 70 % 60 Насіння 85 65 Стерилізація Експозиція, хвилин Експлантат Стерильність експлантатів, % Життєздатні стерильні експлантати, % Мінеральна основа середовища для укорінення Гормони БАП мг/л ТДЗ, мг/л Кінетин, мг/л ІОК мг/л НОК мг/л Кількість новоутворених пагонів, шт. розмноження 2 і Запропонований спосіб Білизна - 35 % 45 Насіння 95 86 MS MS 3 1 5 Показники 0,2-0,5 0,8-1,2 0,6-0,8 0,6-0,8 12-14 UA 76600 U Продовження таблиці 1 Укорінення, % Цукроза, г/л Довжина фотоперіоду, годин Температура культивування, °C Інкубування в темноті, доба Коефіцієнт розмноження Придатність рослин до пересаджування у ґрунт, доба 5 80,0 20,0 16 24±2 3 5 21 97,0 30,0 16 24±2 12 14 Впровадження запропонованої корисної моделі сприятиме отриманню високого виходу стерильних та життєздатних експлантатів, зменшить собівартість та удосконалить склад живильного середовища при розмноженні та укоріненні, зменшить додатковий етап інкубування у темряві експлантатів, пришвидшить отримання розсади та вдвічі збільшить коефіцієнт розмноження сорго цукрового. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Спосіб клонального мікророзмноження сорго цукрового, що включає стерилізацію насіння сорго цукрового, використання для розмноження та укорінення модифікованого середовища за прописом Мурасіге і Скуга, який відрізняється тим, що для стерилізації насіння використовують 35 % розчин Білизни експозицією 45 хвилин, для розмноження у середовище Мурасіге і Скуга додають БАП до 0,2-0,5 мг/л, кінетин 0,8-1,2 мг/л, цукрозу - 30, 0 г/л, для укорінення у середовище Мурасіге і Скуга додають ІОК і НОК - 0,6-0,8 мг/л і 30 г/л цукрози, культивування проводять при 16 годинному фотоперіоді при температурі 24±2 °C з інтенсивністю освітлення 4000-4500 лк, відносній вологості 70-80 %. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3