Спосіб моделювання метастазування злоякісних пухлин у печінку

Реферат: Спосіб моделювання метастазування злоякісних пухлин у печінку передбачає отримання суспензії пухлинних клітин в розчині Хенкса або середовищі 199 та її інокуляцію лабораторним тваринам. При цьому суспензію пухлинних клітин, попередньо стандартизовану до концентрації 6 в діапазоні 2-810 клітин/мл, вводять внутрішньоселезінково. UA 85641 U (12) UA 85641 U UA 85641 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини та експериментальної онкології, а зокрема до способів моделювання метастазування злоякісних пухлин у печінку і може бути використана для розробки способів медикаментозної дії на метастази і метастазування та дослідження нових лікарських засобів для лікування і профілактики злоякісних пухлин та їх метастазування. Відомий спосіб моделювання метастазування злоякісних пухлин у печінку, який передбачає отримання суспензії пухлинних клітин в розчині Хенкса або середовищі 199 та її інокуляцію лабораторним тваринам. [A.M. Козлов, З.П. Софьина. Частота, сроки и тип метастазирования различных перевиваемых опухолей мышей. Бюлетень экспериментальной биологии и медицины - 1978, № 12, с. 715-718]. Згідно зі способом, пухлинну тканину аденокарциноми товстої кишки AKATOЛ подрібнювали ножицями до гомогенної консистенції, розбавляли середовищем № 199 у співвідношенні 1:10 і 0,5 мл одержаної суспензії інокулювали підшкірно в область пахвової западини мишам-самцям лінії BALB/c. Аутопсійний матеріал досліджувався тільки макроскопічним методом. Метастази в органах визначались візуально. Для визначення термінів метастазування був використаний метод, пов'язаний з видаленням первинного пухлинного вузла в різні терміни після перещеплення. Недоліком вказаного способу є низький відсоток лабораторних тварин з метастазами у печінці, внаслідок метастазування аденокарциноми товстої кишки АКАТОЛ за змішаним типом. Зі 100 % тварин виразні метастази в печінці виявлялись лише у 60 % тварин. Ще одним недоліком способу є його довготривалість, зумовлена необхідністю проведення серійного пасажування in vivo для набуття цією пухлиною здатності утворювати метастази в печінці. Без цього аденокарцинома товстої кишки АКАТОЛ метастазує за лімфогенним типом у регіонарні і віддалені лімфовузли. Більш близьким до запропонованої корисної моделі є технічне рішення, вибране як найближчий аналог, спосіб моделювання метастазування злоякісних пухлин у печінку, який передбачає отримання суспензії пухлинних клітин в розчині Хенкса або середовищі 199 та її інокуляцію лабораторним тваринам [Е.В. Фадеева. Экспериментальная модель меланоми Ніби методы иммунотерапии. ГОУ ВПО "Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера Росздрава" Пермь, Россия]. Згідно зі способом меланома В16 перещеплюється на самицях і самцях лінії мишей С57Вl6 шляхом підшкірного або внутрішньочеревного введення 0,5 мл суспензії пухлинної тканини в розчині Хенкса або середовищі 199 (1:10). Недоліком вказаного способу є низький відсоток лабораторних тварин з метастазами у печінці, внаслідок підшкірного або внутрішньочеревного введення нестандартизованої суспензії пухлинних клітин лабораторним тваринам. Зі 100 % тварин виразні метастази виявлялись переважно в легенях у 90 % тварин і в печінці - у 40 % тварин. В основу корисної моделі поставлена задача створити спосіб моделювання метастазування злоякісних пухлин у печінку, який за рахунок стандартизації суспензії пухлинних клітин та нового способу інокуляції суспензії лабораторним тваринам забезпечив би спрямоване метастазування злоякісних пухлин у печінку у 100 % лабораторних тварин у короткий термін. Поставлена задача вирішується тим, що в способі моделювання метастазування злоякісних пухлин у печінку, який включає отримання суспензії пухлинних клітин в розчині Хенкса або середовищі 199 та її інокуляцію лабораторним тваринам, згідно з корисною моделлю, суспензію пухлинних клітин одержують з меланоми В16, клітинам якої властивий гематогенний шлях 6 метастазування, стандартизують до концентрації в діапазоні 2-810 клітин/мл для підрахунку кількості пухлинних клітин на тварину, що забезпечує індивідуальну варіабельність показників пухлинного росту і відтворюваність результатів досліджень, а інокуляцію пухлинних клітин здійснюють внутрішньоселезінковим введенням, яке завдяки існуванню судинного сполучення між печінкою і селезінкою (воротна вена) забезпечує спрямоване метастатичне поширення пухлини у короткий термін. Приклад 1: Суспензію пухлинних клітин для інокуляції лабораторним тваринам одержують шляхом культивування клітин меланоми В16 in vitro (Культура животных клеток. Методы / [пер.с англ. / под ред. Р. Фрешни]. - М.: Мир, 1989. - 333 с.) в Dulbecco modified Eagle medium (DMEM, Sigma) додають 10 % сироватки ембріонів телят (ETC, Sigma), пеніциліну (110 U/mL) та стрептоміцину (100 μΙ/mL) при 37 °С в атмосфері з 5 % СО2. На наступному етапі моделювання суспензію 6 пухлинних клітин стандартизують до концентрації 5x10 клітин/мл, і вводять 100 мкл з 6 5 концентрацією 510 клітин/мл (загальна кількість пухлинних клітин на тварину - 510 ) під капсулу нижньої третини селезінки на глибину 0,5 мм мишам лінії С 57Вl6. Появу метастазів у печінці реєструють на 10-14 добу після перещеплення. На 14 добу метастази у печінці виявляють у 100 % тварин. Показники пухлинного росту і виживаності тварин після внутрішньоселезінкового перещеплення меланоми В16 наведено у таблиці 1. 1 UA 85641 U Таблиця 1 Термін після перещеплення, доба Кількість живих тварин Кількість тварин з метастазами, % Кількість метастазів у печінці Кількість метастазів у легенях Кількість метастазів у інших органах 5 10 15 1 20 0 0 0 0 10 20 75 23,4±3,4 0 0 14 20 100 87,1±5,0 0 0 21 6 100 119,5±8,3 0 0 Приклад 2: Суспензію пухлинних клітин для інокуляції лабораторним тваринам одержують з пухлинної тканини сингенних тварин. Для цього фрагменти пухлинної тканини мишей С 57Вl6 без ділянок некрозу видаляють хірургічним шляхом, промивають стерильним фізіологічним розчином, подрібнюють ножицями і гомогенізують до утворення клітинної суспензії. Отриманий гомогенат пухлинної тканини промивають центрифугуванням для видалення клітинного дебрису, готують суспензію пухлинних клітин у розчині Хенкса або середовищі 199 і стандартизують до 6 концентрації 510 клітин/мл. На наступному етапі моделювання 100 мкл суспензії пухлинних клітин з концентрацією 6 5 510 клітин/мл (загальна кількість пухлинних клітин на тварину - 510 ) вводять під капсулу нижньої третини селезінки на глибину 0,5 мм мишам лінії С 57Вl6. Появу метастазів у печінці реєструють на 10-14 добу після перещеплення. На 14 добу метастази у печінці виявляють у 100 % тварин. Показники пухлинного росту і виживаності тварин після внутрішньоселезінкового перещеплення меланоми В16 наведено у таблиці 2. Таблиця 2 Термін після перещеплення, доба Кількість живих тварин Кількість тварин з метастазами, % Кількість метастазів у печінці Кількість метастазів у легенях Кількість метастазів у інших органах 20 25 30 1 20 0 0 0 0 10 20 75 24,1±7,2 0 0 14 20 100 87,9±11,9 0 0 21 6 100 120,1±12,0 0 0 Печінка являє собою найбільш поширену локалізацію гематогенних метастазів злоякісних новоутворень, не залежно від того чи дренуються вони судинами системи воротної вени або інших судин великого кола кровообігу. Метастази в печінці виявляють приблизно у однієї третини усіх хворих на рак. При цьому у хворих на рак молочної залози, рак легені, товстої кишки або шлунка метастази у печінці виявляються у 50 % пацієнтів. Після перелічених видів раку наступними за частотою метастазування у печінку є рак підшлункової залози і стравоходу, а також меланома. Отже, порівняно з відомими способами, спосіб моделювання метастазування злоякісних пухлин у печінку, що заявляється, дозволяє отримати модельну систему пухлинного росту з первинним пухлинним вузлом у селезінці і метастазами у печінці у 100 % лабораторних тварин, що у 2 рази більше ніж в найближчому аналогу, і скоротити тривалість дослідження ефективності протипухлинних засобів загального призначення та таргетних протипухлинних засобів, спрямованих на лікування і профілактику метастазування злоякісних новоутворень у печінку у два рази. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб моделювання метастазування злоякісних пухлин у печінку, який передбачає отримання суспензії пухлинних клітин в розчині Хенкса або середовищі 199 та її інокуляцію лабораторним тваринам, який відрізняється тим, що суспензію пухлинних клітин, попередньо 6 стандартизовану до концентрації в діапазоні 2-810 клітин/мл, вводять внутрішньоселезінково. 2 UA 85641 U Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3