Спосіб клонального мікророзмноження стевії

Реферат: UA 85694 U UA 85694 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології, селекції, рослинництві, для розмноження, вирощування і отримання розсади цінних селекційних матеріалів та збереження генотипу вихідної форми. Стевія (Stevia rebaudiana Bertoni) - ендемічна рослина родини Asteraceae. Це багаторічна трав'яниста рослина із сімейства складноцвітих (Compozital), що походить з північно-східних провінцій Парагвая та містить у своєму листі комплекс дитерпенових глікозидів. Нині встановлено, що в листі стевії міститься не менше восьми детерпенових глікозидів, що мають солодкий смак. Зокрема, стевіозид солодше цукру в 200 разів, а моноглікозид стевіозид в 30-45 разів. Сьогодні роботи по вивченню стевії з метою її інтродукції і введення в культуру ведуться в Японії, Парагваї, Бразилії, США, Південній Кореї, Китаї, й у ряді інших країн. Готові продукти із застосуванням стевіозидів і очищені глікозиди робляться і реалізуються в різних країнах, тому є важливим її розмноження та селекційна робота з цією культурою. Відомим і найбільш близьким аналогом до корисної моделі є морфогенез в культурі in vitro сегментів стебла і клональне мікророзмноження Arnica Chamissonis Less. Ssp. Foliosa (Nutt.) maguire [Зеленіна Г.А. Морфогенез в культурі in vitro сегментів стебла і клональне мікророзмноження Arnica Chamissonis Less. Ssp. Foliosa (Nutt.) maguire // Автореф. дис. канд. біол. наук.: 03.00.20 - біотехнологія / Нікітський ботанічний сад. - Ялта. - 2007. - 7-8 с.]. Даний спосіб базується на тому, що використовують насіння арніки облисненої, яке стерилізують 15 % перекисом водню упродовж 15 хвилин з наступним дворазовим промиванням стерильною водою і отримують 73 % стерильних експлантів. Життєздатні стерильні експланти становлять 45 %. Культивування насіння проводили на агаризованому живильному середовищі Мурасіге і Скуга з додаванням 2,0 мг/л БАП, а для укорінення додатково додано 1 г/л активованого вугілля. Культуральні посудини з експлантами інкубували в умовах термального приміщення при 24±2 °C, з освітленням 3000-4000 лк, 16-годинному фотоперіоді і відносною вологістю повітря 60-70 %. Коефіцієнт розмноження становить - 5-6 штук рослин. Відомий і пропонований способи клонального мікророзмноження мають спільні ознаки: стерилізація рослинного матеріалу, використання агаризованого живильного середовища, умови культивації, приготування ґрунтових сумішей, висаджування та приживлюваність рослин, вирощування розсади. Проте, використання як експланту насіння стевії не забезпечує достатню кількість стерильних експлантів, не дозволяє отримати високий коефіцієнт при розмноженні та укоріненні рослин. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб клонального мікророзмноження стевії, що дасть можливість підібрати експланти і отримати стерильну культуру, удосконалити склад живильного середовища, підвищити коефіцієнт розмноження. Поставлена задача вирішується тим, що у способі клонального мікророзмноження стевії, що включає стерилізацію рослинного матеріалу, використання агаризованого живильного середовища, умови культивації, висаджування та приживлюваність рослин, вирощування розсади, згідно з корисною моделлю, використовують за експлант апікальні бруньки, які стерилізують розчином сулеми 0,04 % при експозиції 30 хвилин для клонального мікророзмноження використовують модифіковане живильне середовище за прописом Гамборга і Евелега з додаванням: 6-бензиламінопурин (БАП) - 0,05 мг/л, мезоіонозиту - 100 мг/л, тіаміну 0,3 мг/л, цукрози - 45 г/л, для укорінення - індолилоцтову кислоту (ІОК) - 0,5 мг/л, нафтилоцтову кислоту (НОК) - 0,05-0,5 мг/л. Культуральні рослини культивували при температурі 24±2 °C, з освітленням 3000-4000 лк, 16-годинному фотоперіоді і відносною вологістю повітря 60-70 %. Коефіцієнт розмноження становить - 15-20 штук. Культуральні рослини можливо переносити у польові умови на 14 добу. Новими відмінними від найближчого аналога ознаками є: - використання розчину сулеми 0,04 % за експозиції 30 хвилин; - введення в стерильну культуру апікальних бруньок; - використання живильного середовища за прописом Гамборга і Евелега; - використання БАП - 0,05 мг/л; - використання мезоіонозиту - 100 мг/л; - використання тіаміну - 0,3 мг/л; - використання цукрози - 45 г/л; - використання ІОК - 0,5 мг/л; - використання НОК - 0,05-0,5 мг/л. 1 UA 85694 U 5 10 15 20 Відмінні від найближчого аналога ознаки при взаємодії з відомими дозволяють підібрати експланти і отримати стерильну культуру, удосконалити склад живильного середовища, підвищити коефіцієнт розмноження. Ефективність нового способу вирощування вивчали на диплоїдних, тетраплоїдних та гексаплоїдних формах стевії. Результати досліджень вказують, що доцільно для введення і отримання стерильної культури стевії використовувати апікальні бруньки. Оптимальною речовиною для стерилізації встановлена сулема 0,04 % за експозиції 30 хвилин. Експериментально встановлено, що модифіковане живильне середовище за прописом Гамборга і Евелега з додаванням: БАП - 0,05 мг/л, мезоіонозиту - 100 мг/л, тіаміну - 0,3 мг/л, цукрози - 45 г/л, ІОК - 0,5 мг/л, НОК - 0,050,5 мг/л забезпечує отримання коефіцієнта розмноження 15-10 штук, що є втричі вище, ніж у відомому способі. Для здешевлення середовища доцільніше зменшити концентрацію БАП до 0,05 мг/л та НОК - до 0,05-0,5 мг/л. Слід відмітити, що стевія не утворює фенольні сполуки, тому немає потреби використовувати активоване вугілля. Спосіб клонального мікророзмноження стевії здійснюється таким чином: як експлант використовують апікальні бруньки, які поверхнево стерилізують розчином сулеми 0,04 % при експозиції 30 хвилин. Стерильність експлантів - становила - 85 %, а життєздатних - 67 %. Клоновані бруньки пересаджували на модифіковане живильне агаризоване середовище за прописом Гамборга і Евелега з додаванням: БАП - 0,05 мг/л, мезоіонозиту - 100 мг/л, тіаміну 0,3 мг/л, цукрози - 45 г/л, ІОК - 0,5 мг/л, НОК - 0,05-0,5 мг/л. Коефіцієнт розмноження становить 15-20 штук. Культуральні рослини культивували при температурі 24±2 °C, з освітленням 30004000 лк, 16-годинному фотоперіоді і відносною вологістю повітря 60-70 %. Культуральні рослини можливо переносити у польові умови на 14 добу (табл. 1.). Таблиця 1 Показники ефективності використання запропонованого способу клонального мікророзмноження стевії Показники Стерилізація Експозиція, хвилин Експлант Стерильність експлантів, % Життєздатні стерильні експланти, % Мінеральна основа середовища для розмноження і укорінення БАП мг/л (6-бензиламінопурин) Мезоіонозит, мг/л Тіамін, мг/л ІОК, мг/л (індолилоцтова кислота) НОК, мг/л (нафтилоцтова кислота) Активоване вугілля, г/л Кількість новоутворених пагонів, шт. Цукроза, г/л Освітлення, лк Відносна вологість повітря, % Довжина фотоперіоду, годин Температура культивування, °C Коефіцієнт розмноження Придатність рослин до пересаджування у ґрунт, доба Найближчий аналог перекис водню 15 % 15 насіння 73 45 Запропонований спосіб розчин сулеми 0,04 % 30 апікальні бруньки 85 67 Мурасіге і Скуга Гамборга і Евелега 2,0 1,0 1,0 5-6 3000-4000 60-70 16 24±2 5-6 0,05 100 0,3 0,5 0,05-0,5 15-20 45 3000-4000 60-70 16 24±2 15-20 27-30 14 25 Впровадження запропонованої корисної моделі дає можливість підібрати експланти і отримати стерильну культуру, удосконалити склад живильного середовища, підвищити втричі коефіцієнт розмноження. 2 UA 85694 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб клонального мікророзмноження стевії, що включає: стерилізацію рослинного матеріалу, використання агаризованого живильного середовища, створення умов культивації, висаджування та приживлюваність рослин, вирощування розсади, який відрізняється тим, що використовують за експлант апікальні бруньки, які стерилізують розчином сулеми 0,04 % за експозиції 30 хвилин, для клонального мікророзмноження використовують модифіковане живильне середовище за прописом Гамборга і Евелега з додаванням: 6-бензиламінопурину (БАП) - 0,05 мг/л, мезоіонозиту - 100 мг/л, тіаміну - 0,3 мг/л, цукрози - 45 г/л, для укорінення індолилоцтову кислоту (IOК) - 0,5 мг/л, нафтилоцтову кислоту (НОК) - 0,05-0,5 мг/л. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3