Спосіб отримання калюсогенезу у стевії

Реферат: UA 85693 U UA 85693 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології, селекції, генетиці для створення нових форм рослин цукрових буряків. Серед проблем забезпечення населення високоякісними продуктами харчування особливе місце займає задоволення потреби хворих цукровим діабетом в низькокалорійних солодких речовинах. Пошуки замінників цукру розпочалися людством давно, але останнім часом перевага надається не синтетичним, а природним підсолоджувачам, серед яких глікозиди стевії, які відзначаються добрими харчовими якостями та безпекою використання. Стевія є однією із культур, яка являє собою практичний інтерес, як продуцент комплексу солодких дитерпенових глікозидів ент-кауренового ряду з інтенсивно солодким смаком (в 150-400 разів солодші за цукор) низькокалорійних та нетоксичних для людини. За оцінками деяких вчених збір глікозидів з одного гектара стевії по солодкості еквівалентний від 10 до 68 т чистого білого цукру. Із іноземних джерел відомо, що в результаті селекційної роботи зміст солодких глікозидів в сухому листі стевії може бути доведений до 1215 відсотків. Проте, розведення нової культури - стевії ускладнюється тим, що репродуктивне її відтворення в наших умовах утрудняється, оскільки продукування життєздатного насіння цією культурою нестійке. Внаслідок цього переважаючим засобом розмноження стевії є вегетативні та біотехнологічні методи. Відомим і найбільш близьким аналогом до корисної моделі є спосіб отримання калюсогенезу у томатів (В.В. Смирнова, В.А. Смирнов Калюсогенез у томатов. Культура клеток растений и биотехнология. ИФР. Москва. "Наука".-1986. - С.-32). Даний спосіб базується на тому, що як вихідний матеріал для одержання калюсу, використовували томати роду Lycopersicon Tourn. Експлантом слугували стерині сегменти черешків і листових пластинок на яких робили надрізи і висаджували на живильне середовище за прописам Гамборга і Евелега яке доповнене: біотином - 0,1 мг/л, НОК - 0,1-0,3 мг/л, ІОК - 1,5-2,0 мг/л, кінетином - 1,5-2,0 мг/л, цукрозою - 25-27 г/л, феруловою кислотою - 0,14-0,20 мг/л, що дозволяє отримувати масу калюсних глобул в середньому 2,05 г. Культивування проводили в темряві у термостаті протягом трьох тижнів, а потім на світлі при температурі 24±2 °C та 16 годинному фотоперіоді. Відомий і пропонований способи отримання калюсогенезу мають спільні ознаки: використання як експлантів - сегментів черешків та листові пластинки, агаризоване живильне середовище, умови культивування експлантів та калюсу. Проте, за відомого способу використовуючи запропонований склад живильного середовища не можливо отримати калюс у стевії, навіть при використанні різних експлантів. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб отримання калюсогенезу у стевії при використанні різних експлантів, що дає змогу отримати калюс за 3-4 тижні культивування та здешевити і удосконалити склад живильного середовища та підвищити рівень рентабельності. Поставлена задача вирішується тим, що у способі отримання калюсогенезу у стевії включає використання стерильних сегментів черешків та листових пластинок стевії, культивування проводять у темряві, а потім на світлі при температурі 24±2 °C та 16 годинному фотоперіоді, згідно з корисною моделлю, матеріал культивують 2 тижні, а для калюсогенезу використовують середовище Мурасіге і Скуга з додаванням 6-бензиламінопурин (БАП) - 0,5 мг/л, гліцину 1,0 мг/л; гіберелової кислоти - 0,3 мг/л, нафтилоцтової кислоти (НОК) - 0,5 мг/л, індолилоцтової кислоти (ІОК) - 1,0 мг/л; 2,4-Д - 0,5 мг/л та цукрози - 30-50 г/л. Новими відмінними ознаками запропонованої корисної моделі від найближчого аналога є: - використання агаризованого живильного середовища за прописом Мурасіге і Скуга; - культивування у темряві в термостаті упродовж 2 тижнів; - зниження концентрації ІОК - 1,0 мг/л; - використання гліцину - 1,0 мг/л; - використання 2,4-Д - 0,5 мг/л; - використання цукрози - 30,0 г/л; - використання БАП - 0,5 мг/л; - використання гіберелової кислоти - 0,3 мг/л; - використання НОК - 0,5 мг/л. Відмінні від найближчого аналога ознаки при взаємодії з відомими ознаками забезпечують отримання калюсу у стевії, скорочення строків культивування, удосконалення та здешевлення складу живильного середовища, підвищити рівень рентабельності. Ефективність нового способу отримання калюсогенезу у стевії вивчали на вихідному матеріалі диплоїдних, тетраплоїдних та гексаплоїдних формах. 1 UA 85693 U 5 10 Результатами досліджень встановлено, що доцільніше для стевії в культурі in vitro використовувати агаризоване живильне середовище за прописом Мурасіге і Скуга. Важливим слід відмітити і зменшення терміну культивування у темряві в термостаті до 2 тижнів. Недоцільним також виявлено використання ферулової кислоти - 0,14-0,20 мг/л та біотину і кінетину, які були замінені на БАП (6-бензиламінопурин). Дослідженнями також встановлено, що доцільно зменшити і кількість ІОК (індолилоцтової кислоти) до 1,0 мг/л. Введення до складу 2,4Д - 0,5 мг/л забезпечує у живильному середовищі пришвидшення утворення калюсних структур. Запропонований спосіб отримання калюсогенезу у стевії здійснюють таким чином: в як експлант використовують стерильні сегменти черешків та листові пластинки стевії, які висаджують на живильне середовище Мурасіге і Скуга з додаванням БАП - 0,5 мг/л, гліцину 1,0 мг/л; гіберелової кислоти - 0,3 мг/л, НОК - 0,5 мг/л, ІОК - 1,0 мг/л; 2,4-Д - 0,5 мг/л, цукрози 30-50 г/л. Культивують упродовж двох тижнів в темряві при температурі 24±2 °C, потім переносять в термальне приміщення з освітленням і 16 годинним фотоперіодом, що дозволяє отримувати масу калюсних глобул в середньому 2,3 г (табл. 1). 15 Таблиця 1 Показники ефективності використання запропонованого способу отримання калюсогенезу у стевії Показники Відомий спосіб сегменти черешків, листові пластинки Гамборга і Евелега 24±2 темрява 3 16 0,14-0,20 0,1 1,5-2,0 1,5-2,0 0,1-0,3 25-27 2,05 Експлант Мінеральна основа середовища Температура культивування, °C Умови культивування Термін культивування, тижні Довжина фотоперіоду, годин Ферулова кислота, мг/л Біотин, мг/л БАП мг/л ІОК мг/л Кінетин, мг/л Гіберелова кислота, мг/л НОК мг/л 2,4-Д, мг/л Гліцин, мг/л Цукроза, г/л Маса калюсу, г Запропонований спосіб сегменти черешків листові пластинки Мурасіге і Скуга 24±2 темрява 2 16 0,5 1,0 1,0 0,3 0,5 0,5 1,0 30 2,3 Впровадження запропонованої корисної моделі забезпечуватиме отримання калюсу у стевії, скороченні строків культивування, удосконаленні та здешевленні складу живильного середовища, підвищенні рівня рентабельності. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб отримання калюсогенезу у стевії, що включає використання стерильних сегментів черешків та листових пластинок, проведення культивування у темряві, а потім на світлі за температури 24±2 °C та 16 годинному фотоперіоді, який відрізняється тим, що матеріал культивують 2 тижні, а для калюсогенезу використовують середовище Мурасіге і Скуга з додаванням 6-бензиламінопурин (БАП) - 0,5 мг/л, гліцину - 1,0 мг/л; гіберелової кислоти - 0,3 мг/л, нафтилоцтової кислоти (НОК) - 0,5 мг/л, індолилоцтової кислоти (ІОК) - 1,0 мг/л; 2,4-Д - 0,5 мг/л та цукрози - 30-50 г/л. 30 Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2