Спосіб дослідження ефекту свідка за допомогою сумісного культивування лімфоцитів периферичної крові людини з дріжджами saccharomyces cerevisiae

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб сумісного культивування для дослідження ефекту свідка (EC), який включає забір периферичної крові людини з додаванням антикоагулянту (гепарину), приготування поживного середовища шляхом змішування готового середовища (RPMI-1640) з мітогеном (ФГА - фітогемаглютенін) і введення в суміш крові, центрифугування суміші, відбір надосадового шару, додавання до осаду гіпотонічного розчину, витримування суміші в термостаті, центрифугування суміші, відбір надосадового шару, додавання холодного фіксуючого розчину до осаду, охолодження у холодильній камері, повторення процедури фіксації лімфоцитів 3 рази до отримання прозорої суміші, відбір за допомогою мікропіпетки осаду, рівномірне розмазування осаду на охолодженому препаратному склі, випаровування залишків фіксуючого розчину шляхом підпалу скла, аналіз препаратів на наявність хромосомних аберацій під мікроскопом, визначення ефекту свідка за отриманими результатами, який відрізняється тим, що до поживного середовища додають 10 мкг/мл, по 100 мкг/мл стрептоміцину та каноміцину, 100 од. пеніциліну, 106 клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae гаплоїдного штаму розведених в фізіологічному розчині, які потім нагрівають при температурі 40-60 °C протягом 20-40 хв., і додають в шприц з культурою периферичної крові людини, отриману суміш змішують вручну, культуру культивують 48 год., додають 75 мкл 0,005 % антимітогену (колхіцину), після чого через 3,5-4,5 год. суміш переливають в пробірки, зафіксовані на препаратному склі метафази лімфоцитів фарбують 10 хв. у 5 % розчині Романовського-Гімза, розведеному у Gurr буфері.

Текст

Реферат: Спосіб сумісного культивування для дослідження ефекту свідка включає забір периферичної крові людини з додаванням антикоагулянту, приготування поживного середовища шляхом змішування готового середовища з мітогеном і введення в суміш крові, центрифугування суміші, відбір надосадового шару, додавання до осаду гіпотонічного розчину, витримування суміші в термостаті, центрифугування суміші, відбір надосадового шару, додавання холодного фіксуючого розчину до осаду, охолодження у холодильній камері, повторення процедури фіксації лімфоцитів 3 рази до отримання прозорої суміші, відбір осаду, рівномірне розмазування осаду на охолодженому препаратному склі, випаровування залишків фіксуючого розчину шляхом підпалу скла, аналіз препаратів на наявність хромосомних аберацій під мікроскопом, визначення ефекту свідка за отриманими результатами. До поживного середовища додають стрептоміцин, каноміцин, пеніцилін, клітинидріжджів Saccharomyces cerevisiae гаплоїдного штаму розведених в фізіологічному розчині. Нагрівають і додють в шприц з культурою периферичної крові людини, отриману суміш змішують вручну, культуру культивують, додають антимітоген. Суміш переливають в пробірки, зафіксовані на препаратному склі метафази лімфоцитів фарбують у розчині Романовського-Гімза, розведеному у Gurr буфері. UA 85695 U (54) СПОСІБ ДОСЛІДЖЕННЯ ЕФЕКТУ СВІДКА ЗА ДОПОМОГОЮ СУМІСНОГО КУЛЬТИВУВАННЯ ЛІМФОЦИТІВ ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ ЛЮДИНИ З ДРІЖДЖАМИ SACCHAROMYCES CEREVISIAE UA 85695 U UA 85695 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі радіаційної медицини і застосовується для дослідження ефекту свідка (EC) - явища, при якому відбувається ураження клітин, які знаходяться поза зоною дії пошкоджуючого фактору, але будь-яким чином контактують з пошкодженими клітинами. Головною задачею при розробці способу вивчення EC є необхідність відділити опромінені клітини від неопромінених клітин-свідків, на яких і досліджується ЕС. На даний момент для вивчення механізмів, наслідків та особливостей EC розроблено такі основні методики як решітчасте екранування, опромінення тонко сфокусованим променем, перенесення неопромінених клітин, у поживне середовище, в якому піддавались впливу опромінені клітини, та сумісне культивування. Спосіб сумісного культивування на сьогодні є одним з найпоширеніших при дослідженні EC, оскільки є досить швидким та зручним. При використанні способу сумісного культивування зазвичай використовують принцип фізичного розділення опромінених клітин від неопромінених клітин різноманітними мембранами, які пропускають сигнальні молекули, що виділяються опроміненими клітинами, але не дозволяють змішувати дві культури між собою що, також, дозволяє сумісно культивувати клітини різних типів та видів. Також розділення проводять завдяки додаванню в одну з культур специфічного барвника для можливості візуального відмежування клітин-свідків від опромінених клітин [1]. Проте заявлені способи вимагають додаткових витрат на реактиви, матеріали та обладнання (крім необхідних для безпосереднього культивування культур клітин). Крім того, підготовка такого експерименту займає досить часу. Найближчим аналогом до заявленого способу є сумісне культивування лімфоцитів периферичної крові людей (ЛПК) різної статі [2]. Згідно цього способу цитогенетичне дослідження проводять на лімфоцитах периферичної крові від донорів жіночої та чоловічої статі. Цільну кров опромінюють на рентгенівській установці РУМ-17. Цільну кров (неопромінену і опромінену) культивують за загальноприйнятим напівмікрометодом. Для виявлення ефекту свідка використовують змішану культуру з двох різностатевих популяцій лімфоцитів, одна з яких опромінена in vitro в дозі 250 мГр, а іншу залишають неопроміненою і використовують як "свідка". Цитогенетичний аналіз виконують з використанням диференційного G забарвлення метафазних хромосом за методом М. Seabright. Для розрізнення популяцій лімфоцитів у змішаних культурах використовують статеві хромосоми та морфологічні варіанти соматичних хромосом. Хромосомний аналіз проводять, враховуючи аберації хроматидного (хроматидні розриви, обміни) і хромосомного (дицентричні і кільцеві хромосоми, транслокації, пара та перицентричні інверсії, інсерції, термінальні та інтерстиціальні делеції) типів. Під час аналізу реєструють пошкоджені хромосоми та точки розривів згідно з міжнародною номенклатурою ISCN 1995. Отримані дані опрацьовують з використанням методу порівняння середніх величин за Стьюдентом-Фішером. Значним недоліком цього способу, є те, що має витрачатись додатковий час, та зусилля при розрізненні популяцій лімфоцитів від донорів різних статей, а хромосомний аналіз має проводитись лише на метафазних пластинках з повним набором хромосом. Розрізнення різностатевих метафаз за допомогою пошуку морфологічних варіантів соматичних хромосом, може вносити у результат певну помилку, а фактор індивідуальної реакції на опромінення та імунологічної відповіді при сумісному культивуванні, може впливати на отримані результати. Крім того, заявлена методика дозволяє проводити дослідження EC лише по аналізу частоти хромосомних аберацій, що обмежує дослідника у можливостях вивчення проблематики. В основу корисної моделі поставлена задача максимального спрощення способу сумісного культивування клітин, для дослідження особливостей прояву ЕС, та вивчення механізмів його індукції, без втрати точності розділення клітин-донорів від клітин-реципієнтів EC сигналу, та достовірності отриманих результатів. Крім того, стає можливим введення додаткових параметрів для дослідження різних EC-пошкоджень, та методик у вивченні особливостей прояву та індукції ефекту свідка (визначення апоптозу, мікроядер, зміни експресії генів, точкових мутацій, та ін.). Поставлена задача вирішується тим, що у способі сумісного культивування для дослідження ефекту свідка (EC), який включає забір периферичної крові людини з додаванням антикоагулянту (гепарину), приготування поживного середовища шляхом змішування готового середовища (RPMI-1640) з мітогеном (ФГА - фітогемаглютенін) і введення в суміш крові, центрифугування суміші, відбір надосадового шару, додавання до осаду гіпотонічного розчину, витримування суміші в термостаті, центрифугування суміші, відбір надосадового шару, додавання холодного фіксуючого розчину до осаду, охолодження у холодильній камері, повторення процедури фіксації лімфоцитів 3 рази до отримання прозорої суміші, відбір за допомогою мікропіпетки осаду, рівномірне розмазування осаду на охолодженому препаратному 1 UA 85695 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 склі, випаровування залишків фіксуючого розчину шляхом підпалу скла, аналіз препаратів на наявність хромосомних аберацій під мікроскопом, визначення ефекту свідка за отриманими результатами, згідно з корисною моделлю, до поживного середовища додають 10 мкг/мл, по 6 100 мкг/мл стрептоміцину та каноміцину, 100 од. пеніциліну, 10 клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae гаплоїдного штаму розведених в фізіологічному розчині, які потім нагрівають при температурі 40-60 °C протягом 20-40 хв., і додають в шприц з культурою периферичної крові людини, отриману суміш змішують вручну, культуру культивують 48 год., додають 75 мкл 0,005 % антимітогену (колхіцину), після чого через 3,5-4,5 год. суміш переливається в пробірки, зафіксовані на препаратному склі метафази лімфоцитів фарбують 10 хв. у 5 % розчині Романовського-Гімза, розведеному у Gurr буфері. Для постановки даної системи сумісного культивування пропонуємо використовувати спосіб наведений нижче. Як клітини-донори EC сигналу використовують гаплоїдний штам дріжджів. Зразки периферичної крові людини венозної крові збирають з додаванням гепарину, та культивують. У 5 мл поживного середовища RPMI-1640 (AppliChem) додається мітоген ФГА (Sigma) 10 мкг/мл, по 100 мкг/мл стрептоміцину та каноміцину, 100 од. пеніциліну. У готове поживне середовище додається по 1 мл цільної крові. Отриману суміш культивують у термостаті, виставленому на t +37 °C, 52 год. На 48-й годині культивування обережно додають до кожного зразку по 75 мкл 0,005 % розчину колхіцину і культивують у термостаті ще 4 години. Перед початком культивування проводять експериментальну контамінацію культур 6 обробленими або необробленими клітинами дріжджів S. cerevisiae (у кількості 10 клітин на культуру), розчинених з фізіологічному розчині. Оброблені дріжджі нагрівають при температурі 40-60 °C протягом 20-40 хв. Після культивування пробірки з сумішшю центрифугують 10 хвилин, при швидкості 1000 об/хв. Супернатант відділяють від клітинного осаду, і додають 0,5 % гіпотонічного розчину KСl по 10 мл у кожну пробірку. Пробірки поміщають на 30 хв. в термостат виставлений на t +37 °C. Центрифугують пробірки 10 хвилин. Знімають надосадову рідину, і перемішавши осад за допомогою вортекса обережно доливають 6 мл щойно приготовленої фіксуючої суміші (етиловий спирт і крижана оцтова кислота у співвідношенні 3:1). Охолоджують пробірки у морозильній камері 20 хв., і центрифугують пробірки 10 хв. Відмивання лімфоцитів проводять ще 3 рази. Пробірки можна зберігати протягом 2 діб у морозильній камері. Для приготування препаратів метафазних пластинок, пробірки центрифугують протягом 10 хвилин, при швидкості 1000 об/хв. Додають до отриманої клітинної суміші не більше 0,5 мл фіксуючої суміші. Розкапують рідину на попередньо знежирене і охолоджене у морозильній камері предметне скло. Підпалюють предметне скло з фіксуючою сумішшю, дочекавшись доки полум'я не згасне. Препарати шифрують. Готові препарати фарбують у 5 % розчині Романовського-Гімза, розведеному у Gurr буфері, протягом 10 хв. При аналізі препаратів метафазних пластинок лімфоцитів периферичної крові людини, враховують кількість аберацій хромосомного та хроматидного типу. У кожному експерименті аналізують не менше 200 метафазних пластинок. Статистичну обробку результатів для характеристики цитогенетичних параметрів хромосомної нестабільності проводять за стандартними способами. Завдяки заявленому способу нами вперше було продемонстровано чіткий прояв ефекту свідка [3], особливості його прояву та індукції між еволюційно далекими видами. Джерела інформації: 1. W. Han., L. Wu., S. Chen., K. N. Yu Exogenous carbon monoxide protects the bystander Chinese hamster ovary cells in mixed coculture system after alpha-particle irradiation // Carcinogen., Vol.31., pp. 275-280. 2. Shemetun, O.V. and Pilins'ka, M.A., Modeling Radiation-induced Bystander Effect in a Culture of Human Peripheral Blood Lymphocytes, in Genetich. Posled. Chrezvych. Radiats. Situatsii (Genetic Consequences of Radiation Accidents), Proc. Third Intern. Conf. (Dubna, October 4-7, 2005), Moscow, 2005, pp. 136-138. 3. O.P. Vasylenko, O.V. Pronina and S.R. Rushkovsky Bystander effect in human lymphocytes incubated with irradiated mitochondrial DNA deficient yeast cells // Radioprot.-2012. - Vol. 46, № 6 P. 555. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 60 Спосіб сумісного культивування для дослідження ефекту свідка (EC), який включає забір периферичної крові людини з додаванням антикоагулянту (гепарину), приготування поживного 2 UA 85695 U 5 10 15 середовища шляхом змішування готового середовища (RPMI-1640) з мітогеном (ФГА фітогемаглютенін) і введення в суміш крові, центрифугування суміші, відбір надосадового шару, додавання до осаду гіпотонічного розчину, витримування суміші в термостаті, центрифугування суміші, відбір надосадового шару, додавання холодного фіксуючого розчину до осаду, охолодження у холодильній камері, повторення процедури фіксації лімфоцитів 3 рази до отримання прозорої суміші, відбір за допомогою мікропіпетки осаду, рівномірне розмазування осаду на охолодженому препаратному склі, випаровування залишків фіксуючого розчину шляхом підпалу скла, аналіз препаратів на наявність хромосомних аберацій під мікроскопом, визначення ефекту свідка за отриманими результатами, який відрізняється тим, що до поживного середовища додають 10 мкг/мл, по 100 мкг/мл стрептоміцину та каноміцину, 100 од. 6 пеніциліну, 10 клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae гаплоїдного штаму розведених в фізіологічному розчині, які потім нагрівають при температурі 40-60 °C протягом 20-40 хв., і додають в шприц з культурою периферичної крові людини, отриману суміш змішують вручну, культуру культивують 48 год., додають 75 мкл 0,005 % антимітогену (колхіцину), після чого через 3,5-4,5 год. суміш переливають в пробірки, зафіксовані на препаратному склі метафази лімфоцитів фарбують 10 хв. у 5 % розчині Романовського-Гімза, розведеному у Gurr буфері. Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3

Дивитися

Додаткова інформація

МПК / Мітки

МПК: C12Q 1/02, G01N 33/49

Мітки: ефекту, спосіб, людини, дріжджами, saccharomyces, cerevisiae, сумісного, дослідження, крові, допомогою, свідка, культивування, лімфоцитів, периферичної

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/5-85695-sposib-doslidzhennya-efektu-svidka-za-dopomogoyu-sumisnogo-kultivuvannya-limfocitiv-periferichno-krovi-lyudini-z-drizhdzhami-saccharomyces-cerevisiae.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб дослідження ефекту свідка за допомогою сумісного культивування лімфоцитів периферичної крові людини з дріжджами saccharomyces cerevisiae</a>

Подібні патенти