Спосіб діагностики диспластичних невусів

Реферат: Спосіб діагностики диспластичних невусів включає проведення огляду шкірних покривів, проведення дерматоскопії і проведення біопсії, проведення імуногістохімічного дослідження. Додатково проводять гістологічну оцінку ступеня дисплазії і досліджують маркери клітинного оновлення Всl-2, р-53, Кі-67. UA 86806 U (12) UA 86806 U UA 86806 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до області медицини, а саме до дерматології, онкології, патологічної анатомії, і може бути використана для проведення диференційної діагностики меланоцитарних новоутворень шкіри, зокрема, диспластичних невусів, прогнозування їх малігнізації. Як прототип вибраний спосіб діагностики диспластичних невусів (Immunohistochernical studies of atypical conjunctival melanocytic nevi Frederick A. Jakobiec, Kathryn Colby, Ann M. Bajart, S. John Saragas, Alexandre Moulin // Arch Ophthalmol. - 2009. - 127, №8. - P. 970-980), який включає проведення огляду кон'юнктиви, виконання дерматоскопії і взяття біопсії з наступним визначенням в біоптатах за допомогою імуногістохімічного методу моноклональних антитіл S100, MART-1, НМВ-45, CD45, CD68, CD 1a, Кі-67. Ознаками, які співпадають із суттєвими ознаками запропонованого способу, є: проведення огляду шкірних покривів, проведення дерматоскопії і біопсії, проведення імуногістохімічного дослідження. Ознаками, що перешкоджають досягненню очікуваного технічного результату (підвищення точності і інформативності діагностики), є: не визначають і не враховують комплекс показників, які свідчать про порушення контролю клітинного циклу, регуляції процесів апоптозу і активації шляхів внутрішньоклітинної передачі мітогенного сигналу, що не дозволяє прогнозувати рецидивування, прогресування і можливу малігнізацію диспластичних невусів. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення способу-прототипу шляхом визначення імуногістохімічних маркерів клітинного оновлення в біоптатах із ураженої шкіри, що дозволяє досягти очікуваного технічного результату. А саме здійснювати прогнозування рецидивів і малігнізації диспластичних невусів. Поставлена задача вирішується тим, що в способі діагностики диспластичних невусів, який включає проведення огляду шкірних покривів, проведення дерматоскопії і проведення біопсії, проведення імуногістохімічного дослідження, згідно з корисною моделлю, додатково проводять гістологічну оцінку ступеня дисплазії і досліджують маркери клітинного оновлення Всl-2, р-53, Кі67. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом визначається наступний: додаткове проведення гістологічної оцінки ступеня дисплазії і дослідження місцевих маркерів клітинного оновлення Всl-2, р-53, Кі-67 дозволяє виділити групи пацієнтів з ознаками високої функціональної активності маркерів клітинного оновлення, що, в свою чергу, дозволяє підвищити точність і інформативність діагностики, а також в подальшому призначити адекватну комплексну терапію для ефективної профілактики рецидивування і малігнізації диспластичних невусів. Маркери клітинного оновлення Всl-2, р-53, Кі-67 відіграють важливу роль у виникненні і подальшому рості злоякісних новоутворень шкіри шляхом порушення контролю клітинного циклу, регуляції процесів апоптозу та активації шляхів внутрішньоклітинної передачі мітогенного сигналу в шкірі та є чинником ризику розвитку проліферативних змін, атипових клітин і рецидивів, тому виділення групи пацієнтів з дисбалансом маркерів клітинного оновлення дозволяє підвищити точність і інформативність діагностики і в подальшому призначати адекватну комплексну терапію для ефективної профілактики рецидивування і малігнізації диспластичних невусів (ДН). Спосіб діагностики полягає в наступному. Пацієнтам після проведення огляду шкірних покривів, проведення дерматоскопії і взяття біопсії шкіри, проводять додаткове визначення гістологічного ступеня дисплазії та досліджують імуногістохімічні маркери клітинного оновлення Всl-2, р-53, Кі-67. Матеріалом дослідження служили біоптати шкіри. Фрагменти шкіри розмірами 1,0 см  1,0 см  0,5 см фіксують у нейтральному забуференому формаліні зі звичайною проводкою і заливкою в парафін згідно стандартної методики. Із парафінових блоків готують серійні зрізи товщиною 4-5 мкм. З метою оглядового забарвлення, гістологічні зрізи забарвлюють гематоксиліном і еозином. Імуногістохімічне дослідження шкіри проводять за стандартизованою методикою з використанням серійних парафінових зрізів, поміщених на адгезивні скельця, покриті полізином ("Menzel-Glaser", Німеччина) і реактивів компанії DAKO з моноклональними антитілами (МкАТ) на автостейнері DAKO. В імуногістохімічній оцінці експресії mtp53 використовують мишачі МкАТ до р53, клон DO-7, IgG2b (M7001 "DakoCytomation") в розведенні 1:100 при часі експозиції 60 хвилин. Критерієм позитивної реакції вважають забарвлення 10 % і більше ядер пухлинних клітин. 1 UA 86806 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Маркер Всl-2 виявляють за допомогою МкАТ до Всl-2, клон Всl-2/124 (M0887"DakoCytomation"), в розведенні 1:80 при інкубації 60 хвил. Позитивною вважають реакцію при цитоплазматичному і мембранному забарвленні більше 10 % пухлинних клітин. Маркер Кі-67, клон МІВ-1 (F7268 "DakoCytomation"), який експресується в ядрах мітотично активних клітин. Ідентифікація реакцій проводилась за допомогою системи візуалізації En Vision™ FLEX+ і додаткового забарвлення гематоксиліном Майера для відтворення структурної організації тканини. Оцінку рівня внутрішньоядерної експресії апоптотичного білка р53 і маркера Кі-67, мембранної експресії маркера Всl-2 проводили з урахуванням інтенсивності забарвлення і розподілу в пухлинній тканині у відсотковому еквіваленті на 100 клітин в 10 випадково вибраних полях зору мікроскопа (збільшення 40) гістологічних зрізів. У випадку, де відсоток позитивних не перевищував 20 %, реакція розцінюється як слабка. Якщо відсоток позитивних клітин був більше 20 %, реакція вважається вираженою. Перегляд і цифрові фотографії мікропрепаратів здійснювали цифровою камерою OLYMPUS С 5050Z, установленою на мікроскопі "Olympus CX-41". Всі одержані результати піддані статистичній обробці для параметричних і непараметричних критеріїв з використанням програми "MedStat". При аналізі перевірки розподілу на нормальність використовували Хі-квадрат і критерій W Шапіро-Уїлка, порівнння центральних тенденцій двох незалежних виборок з використанням Wкритерія Вілкоксона і порівняння середніх двох незалежних виборок за критерієм Ст'юдента. Для множинного порівняння непараметричних даних використовували ранговий однофакторний аналіз Крускала-Уолліса і критерій Дана. Заявлений спосіб діагностики був застосований у 62 пацієнтів, із яких було 29 чоловіків і 33 жінки ц віці від 42 до 83 років (середній вік 54,16±3,02 роки). При гістологічному дослідженні мікропрепаратів зі встановленим діагнозом диспластичний невус визначалась лентигіозна меланоцитарна дисплазія з різним ступенем виразності. У 31 випадку відмічалась слабковиражена дисплазія - ДН 1 ступеня дисплазії, ДН - 2 ступеня дисплазії відмічалась у 18 випадках і в 13 випадках - відмічався ДН - 3 ступеня дисплазії. Результати проведеного нами ІГХ дослідження показали, що при підсиленні ступеня диспластичних проявів збільшується кількість атипових меланоцитів, що експресують р53, Всl-2 і Кі-67. Найменший рівень апоптотичного білка р53 в ядрах меланоцитів спостерігався при ДН 1 ступеня дисплазії і становив 11,6±0,7 %. Найбільший - при ДН 3 ступеня дисплазії становив 37,3±0,8 %. При цьому достовірність відмінностей між групами статистично значима (Р>0,05). Цитоплазматична і мембранна експресія Всl-2 також підсилювалась залежно від ступеня дисплазії меланоцитів. При ДН 1 ступеня дисплазії рівень експресії Всl-2 становив 9,4±0,4 %. При ДН 2 ступеня дисплазії експресія становила 10,2±0,7 %. Найбільш виражена позитивна реакція до Всl-2 виявлялась в 23,4±0,7 % серед меланоцитів ДН 3 ступеня. Експресія маркера Кі-67 виявлялась тільки в одиничних клітинах (1,1±0,6 %) при ДН 1 ступеня, 4,87±0,8 % при ДН 2 ступеня і 7,63±2,7 % при ДН 3 ступеня. Застосування заявленого способу дозволяє покращити діагностику і диференційну діагностику диспластичних невусів за рахунок ІГХ визначення маркерів клітинного оновлення. Імуногістохімічне визначення маркерів клітинного оновлення Всl-2, р-53, Кі-67 залежно від ступеня дисплазії ДН сприяє більш глибокому розумінню механізмів малігнізації ДН і виникнення злоякісних новоутворень шкіри. Виявлені зміни експресії Всl-2, р-53, Кі-67 є ранніми показниками процесів інвазії і метастазування, що дозволяє розглядати виявлені зміни як маркери ранньої диференційної діагностики і прогнозу доброякісних і злоякісних меланоцитарних новоутворень шкіри. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 Спосіб діагностики диспластичних невусів, який включає проведення огляду шкірних покривів, проведення дерматоскопії і проведення біопсії, проведення імуногістохімічного дослідження, який відрізняється тим, що додатково проводять гістологічну оцінку ступеня дисплазії і досліджують маркери клітинного оновлення Всl-2, р-53, Кі-67. 2 UA 86806 U Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3