Спосіб отримання флавінмононуклеотиду (5′-фмн)

Спосіб отримання флавінмононуклеотиду (5'ФМН), що полягає у введенні в геном мікроорганізмів генетичної інформації про синтез флавінмононуклеотиду, який відрізняється тим, що промотор гена FMN1 (кодує рибофлавінкіназу) дріжджів Debaryomyces hansenii вирізають, замінюють його на сильний промотор фактора елонгації трансляції - TEF1 дріжджів Candida famata, конструюють вектор для надекспресії гена FMN1 для введення в геном Candida famata фрагмента ДНК, що несе генетичну інформацію про синтез 5'-ФМН, вибраний з групи: вектор відповідно до Фіг. 2 або вектор відповідно до Фіг. 3, отримують рекомбінантні штами з підвищеною в 5-8 разів, в порівнянні з реципієнтним штамом, активністю рибофлавінкінази, у культуральній рідині яких нагромаджується 5'-ФМН. Винахід відноситься до галузі біотехнології і є способом отримання флавінмононуклеотиду (ФМН) за допомогою рекомбінантних штамів дріжджів Candida famata (С. famata). 5'-ФМН (рибофлавін-5'-фосфат) є сполукою, яка відіграє важливу роль як коензим у різноманітних ферментативних реакціях у живих організмах і є ефективним засобом профілактики і лікування захворювань, пов'язаних з порушенням біосинтезу цієї сполуки. Препарати ФМН, отримані ферментативним способом, можуть знайти застосування як: 1 - лікарські препарати, які не містять домішок з невстановленою біологічною активністю; 2 - реактиви високого ступеня чистоти; 3 - проміжні продукти для отримання флавінаденіндинуклеотиду (ФАД) та його похідних; 4 - компоненти системи біолюмінісцентного аналізу. Відомо, що 5'-ФМН у промислових масштабах отримують шляхом фосфорилювання рибофлавіну (РФ) хімічними агентами [1], що приводить до утворення препарату, який містить побічні продукти: ізомерні форми флавінмононуклеотиду, такі як 2'-ФМН і 4'-ФМН, рибофлавін динуклеотиди (5',4'ФДН і 5',3'-ФДН), а також поліфосфати, які не мають вітамінної активності. Очищення 5'-ФМН від цих сполук є складним завданням. Комерційні препарати містять не більше 74% натрієвої солі 5'ФМН, крім того, препарати ФМН, отримані таким способом, є дуже дорогими, що знижує можливості їх широкого використання у практиці. Відомо досить багато мікроорганізмів, здатних до надсинтезу РФ, зокрема, рекомбінантні штами бактерій Bacillus subtilis, цвільовий гриб Ashbya gossypii та флавіногенні дріжджі С. famata [2, 3]. Однак не описано жодного прикладу прямого мікробного синтезу значних кількостей ФМН. Найбільш близьким до запропонованого є спосіб отримання ФМН, в якому використані бактерії родів Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Enterobacter і Pseudomonas, що містять рекомбінантну ДНК з фрагментом, який несе генетичну інформацію про синтез ФМН [4]. Однак у цих мікроорганізмів перетворення РФ до ФМН і наступну реакцію, фосфорилювання ФМН до ФАД, здійснює (19) UA (11) 87684 (13) (21) a200612203 (22) 20.11.2006 (24) 10.08.2009 (46) 10.08.2009, Бюл.№ 15, 2009 р. (72) ВОРОНОВСЬКИЙ АНДРІЙ ЯРОСЛАВОВИЧ, ДМИТРУК КОСТЯНТИН ВАСИЛЬОВИЧ, ІЩУК ОЛЕНА ПЕТРІВНА, СИБІРНИЙ АНДРІЙ АНДРІЙОВИЧ, ФЕДОРОВИЧ ДАРІЯ ВАСИЛІВНА, ЯЦИШИН ВАЛЕНТИНА ЮРІЇВНА (73) ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ НАН УКРАЇНИ (56) Stahmann K.P. et al. Microbiol. and Biotechnol. 2000. - Vol. 53, N5 - P. 509-516. Сибірний А.А. і співавт. Мікробний синтез флавінів, Київ: Наукова думка, 2006, с.41-50. US 5514574, 07.05.96. Manstein D.J. and Pai E.F.J. Biol. Chem. - 1986. Vol. 261, №34. - P. 16169-16173. Voronovsky A.A. et al. // FEMS Yeast Research. 2002. - Vol. 2. - P. 381-388. EP 0147713 B1, 30.08.89. C2 1 3 той самий білок [5], тому в культурах нагромаджуються обидва нуклеотиди - ФМН і ФАД. В основу винаходу поставлено завдання за допомогою генноінженерних підходів сконструювати рекомбінантні штами дріжджів з високою активністю рибофлавінкінази (РФ-кіназа), здатні до надсинтезу ФМН. Поставлене завдання досягається тим, що у способі отримання флавінмононуклеотиду (5'ФМН), який полягає у введенні в геном мікроорганізмів генетичної інформації про синтез ФМН, згідно з винаходом промотор гену FMN1 (кодує РФкіназу) дріжджів Debaryomyces hansenii (D. hansenii) вирізають, замінюють на сильний промотор фактора елонгації трансляції - TEF1 дріжджів С. famata, конструюють вектори для надекспресії гену FMN1, за допомогою яких в геном С. famata вводять фрагмент ДНК, що несе генетичну інформацію про синтез 5'-ФМН, отримують рекомбінантні штами з високою активністю РФ-кінази, в культуральній рідині яких нагромаджується 5'-ФМН. Суть винаходу полягає у введенні в геном дріжджів фрагменту ДНК, який несе генетичну інформацію про синтез ФМН під контролем сильного конститутивного промотора, що забезпечує високий рівень експресії гена FMN1 і нагромадження цільового продукту - ФМН, а не суміші флавінових нуклеотидів, ФМН і ФАД, як це має місце при використанні бактерійної моделі [5]. Біосинтез ФМН і ФАД у дріжджів С. famata здійснюєтьсяза допомогою послідовної каталітичної дії 2 різних ферментів - РФ-кінази (КФ 2.7.1.26) та ФАД-синтетази (КФ 2.7.27.2), які забезпечують утворення ФМН і ФАД у незначній кількості, необхідній для життєдіяльності клітини. [3]. У запропонованому способі використовують такі методи: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), конструювання рекомбінантних плазмід, виділення плазмід з Escherichia coli, рестрикційний аналіз, електрофорез в агарозному гелі, трансформація Е. coli методом електропорації, описані в [6]. Трансформацію С. famata проводять, як описано в [7]. Виділення сумарної ДНК з трансформантів С. famata проводиться як для S. cerevisiae [8]. Спосіб отримання ФМН ілюструється графічними матеріалами. На Фіг. 1 зображено нуклеотидну послідовність відкритої рамки зчитування та термінатора гена РФ-кінази FMN1 дріжджів D. hansenii, де інтрон вказаний нежирним шрифтом, старт- та стопкодони підкреслені, термінатор позначено курсивом нежирним шрифтом. 87684 4 Послідовність взято з банку даних "Genolevures: Debaryomyces hansenii", http://cbi.labri.fr/Genolevures/elt/DEHA). На Фіг. 2. зображено лінійну схему плазміди p19L2+prTEF1+FMN1Dh, де фрагмент, що містить ген LEU2 S. cerevisiae, позначено сірою смугою; фрагмент, що містить промотор TEF1 С. famata, позначено вертикальними штрихами; фрагмент, що містить відкриту рамку зчитування FMN1 D. hansenii, позначено білою смугою; інтрон FMN1 D. hansenii, позначено крапками; тонкою чорною лінією позначено бактерійну частину вектора. Сайти рестрикції позначено: Η - HindIII, Sp - SphI, Ρ - PstI; К - ΚpnI; RI - EcoRI; S1 - SalI; Xb - ХbаI; В - BamHI; Sm - SmaI; Sc - SacI. На Фіг. 3 зображено лінійну схему плазміди p19L2+b1e+RIBCf+prTEF1+FMN1Dh, де фрагмент, що містить ген RIB1 С. famata, позначено горизонтальними смугами; фрагмент, що містить ген ble S. aureus позначено діагональним штрихом; фрагмент гена LEU2 S. cerevisiae, позначено сірою смугою; фрагмент, що містить промотор TEF1 С. famata, позначено вертикальними штрихами; фрагмент, що містить відкриту рамку зчитування FMN1 D. hansenii, позначено білою смугою; інтрон FMN1 D. hansenii, позначено крапками; тонкою чорною лінією позначено бактерійну частину вектора. Сайти рестрикції позначено: Η - HindIII; Sp - SphI, P PstI; К - KpnI; S - SalI; Sm - SmaI; Xb - XbaI; Sc SacI; RI - ЕсоRI; В - BamHI. Спосіб здійснюють кількома етапами. Етап 1. Конструювання плазміди, що містить ген FMN1 Debaryomyces hansenii під промотором TEF1. Відкриту рамку зчитування (ВРЗ), що містить інтрон, а також термінатор гену FMN1 D. hansenii (Фіг. 1) ампліфікують за допомогою ПЛР з використанням геномної ДНК D. hansenii як матриці та праймерів А51 і А52 (Табл. 1). Фрагмент очікуваної величини (824 пари нуклеотидів, (п.н.)) обробляють рестриктазою Sall (сайти цього фермента фланкують одержаний продукт ПЛР). Фрагмент, що містить промотор TEF1 С. famata, ампліфікують за допомогою ПЛР з використанням праймерів Р7-2В і P7-3S (Табл. 1) та геномної ДНК С. famata як матриці. Продукт очікуваної величини (658 п.н.) обробляють рестриктазами ВаmНІ та SalI, сайти яких фланкують цей продукт. BamНІ/SalІ-фрагмент з промотором TEF1 С. famata та SalI-фрагмент з ВРЗ і термінатором FMN1 D. hansenii клонують на вектор p19L2 [7]. Сконструйовану плазміду позначено p19L2+prTEF1+FMN1Dh (Фіг. 2). Таблиця 1 Перелік праймерів, які використовують у 1, 2 та 3 етапах способу Назва праймера Р7-2В P7-3S А51 А52 Ко36 Послідовність нуклеотидів 5'-TGC GGA ТСС ТАА CGA АСА GCT CAT CAG-3' 5'-TGC GTC GAC TTT GCT ТАА TGT ΑΤΑ ΑΤΑ ΑΤΑ G-3' 5’-ССС GTC GAC ATG ACG AGA ССТ GAA ACT CAC GTT СС-3’ 5'-CGG GTC GAC ССТ ТАА GTA ААА GTA ССС САА ААТ AG ААС G-3' 5'-ТТТ GAG СТС ATG ТТА CAG ТСТ АТС CCG GC-3' 5 87684 Етап 2. Конструювання рекомбінантних штамів C.famata Плазмідою p19L2+prTEF1+FMN1Dh, попередньо лінеаризованою рестриктазою НіndIII, трансформують реципієнтний штам С. famata L20105 (leu2). Трансформацію проводять методом електропорації, селекцію Leu+-трансформантів проводять на мінімальному середовищі Беркгольдера без лейцину [7]. Серед низки трансформантів відбирають стабільні Leu+-інтегранти. Наявність в геномі трансформантів гену FMN1 D. hansenii під промотором TEF1 С. famata перевіряють за допо 6 могою ПЛР з використанням відповідної пари праймерів (Р7-2В та А52) (Табл.1). Інтегранти, що містять цю рекомбінантну конструкцію, відбирають для перевірки активності РФ-кінази та продукції ФМН. Трансформанти вирощують протягом 2 діб в колбах Ерленмейєра у середовищі з низьким вмістом заліза (0,01мг Fe/л). Частина відібраних рекомбінантних штамів №3, 9, 18, 33 мають у 3-6 разів вищу активність РФ-кінази у порівнянні з вихідним штамом С. famata L20105 і рекомбінантним штамом К9, отриманим трансформацією тією ж плазмідою, але без гену FMN1 (Табл. 2). Таблиця 2 Активність РФ-кінази та вміст флавінів в культуральній рідині рекомбінантних штамів С. famata, що містять ген FMN1 D. hansenii під контролем промотора TEF1 Штам L20105 (контроль) К9(контроль) 3 9 18 33 Активність РФ-кінази, мкмоль ´ 10-5 / хв ´ мг білка 20,4 27,8 70,0 121,7 111,7 86,1 В культуральному середовищі отриманих рекомбінантних штамів 25-34% від загального вмісту флавінів припадає на ФМН, в той час як у вихідного штаму L20105 та штаму К9 вміст ФМН не перевищує 10%. Етап 3. Конструювання плазміди для введення в геном додаткової копії гену FMN1 та селекція відповідних трансформантів Для подальшого покращення продуцентів ФМН у геном відібраних трансформантів вводять додаткові копії гену FMN1 D. hansenii під контролем промотора TEF1 С. famata. Для цього конструкцію, що містить промотор TEF1 з геном FMN1, переклоновують у вектор, який містить ген blе Staphylococcus aureus (забезпечує стійкість до флеоміцину). Сконструйована плазміда отримала назву p19L2+ble+RIBCf+prTEF1+FMN1Dh. ЇЇ лінійна схема представлена на Фіг. 3. Плазмідою p19L2+ble+RIB1Cf+prTEF1+FMN1Dh трансформують реципієнтний штам С. famata №18, який має підвищену активність РФ-кінази і нагромаджує в культуральній рідині 28% ФМН від загального вмісту флавінів (Табл. 3). Трансформанти, резистентні до флеоміцину, відбирають на мінімальному середовищі Беркгольдера, що містить флеоміцин ФМН 0,2 0,45 0,80 1,35 1,30 1,30 Флавіни культуральної рідини, мг/л Сумарна кількість флавінів % ФМН 3,39 6 5,29 9 3,22 25 4,65 29 4,60 28 3,83 34 у концентрації 1.8мг/л. Серед низки трансформантів відбирають стабільні інтегранти, резистентні до флеоміцину. Наявність в геномі трансформантів частини плазміди p19L2+ble+RIBCf+prTEF1+FMN1Dh, що містить ген FMN1 D. hansenii під промотором TEF1 С. famata та ген blе, перевіряють за допомогою ПЛР з використанням відповідної пари праймерів (Р7-2В та Ко36) (Табл. 1). Інтегранти, що містять цю рекомбінантну конструкцію відбирають для подальшого аналізу. Наявність декількох копій гена FMN1 підтверджують за допомогою Саузерн-блот аналізу [6]. Для перевірки активності РФ-кінази і продукції ФМН отримані трансформанти вирощують протягом 2 діб у середовищі з низьким вмістом заліза (0,01мг Fe/л). Відібрані рекомбінантні штами характеризуються в 3-4,5 рази вищою активністю РФкінази в порівнянні з реципієнтним штамом С. famata №18 і в 13-17 разів - порівняно із рекомбінантним штамом К9, отриманим трансформацією плазмідою без гена FMN1 (Табл. 2, 3). В культуральній рідині отриманих рекомбінантних штамів вміст ФМН у 4-5 разів вищий, ніж у реципієнтного штама С famata №18. 7 87684 8 Таблиця 3 Активність РФ-кінази та вміст флавінів в культуральній рідині рекомбінантних штамів С. famata, що містять додаткові копії гену FMN1 D. hansenii під контролем промотора TEF1 Штам Копійність Активність РФ-кінази, мкмоль ´ 10-5 / хв ´ мг білка 18 18/13 18/17 18/19 18/21 2-3 не визначали 3-4 6-8 6-8 107,3 448,6 351,1 468,1 482,7 Етап 4. Отримання штамів, здатних до надпродукції ФМН, шляхом трансформації плазмідою p19L2+ble+RIBCf+prTEF1+FMN1Dh штаму С. famata ATCC 20849-надсинтетика рибофлавіну. Зростання вмісту ФМН в культуральній рідині спостерігається тільки при вирощуванні рекомбінантних штамів в середовищі з низьким вмістом заліза, коли синтезується значна кількість РФ і є значно нижчим при достатньому забезпеченні залізом. Необхідність створення дефіциту заліза Флавіни культуральної рідини, мг/л Сумарна кількість % ФМН ФМН флавінів 1,30 4,60 28 4,95 15,95 31 6,33 28,33 23 5,50 13,75 40 5,50 10,73 52 становить значну перешкоду для отримання препарату ФМН у великих кількостях. Тому плазмідою p19L2+ble+RIB1Cf+prTEF1+FMN1Dh трансформують штам С. famata ATCC 20849, продукція РФ у якого не залежить від забезпечення залізом. Активність РФ-кінази і вміст ФМН визначають після 2,5 діб вирощування трансформантів в мінімальному середовищі Беркгольдера без додавання заліза. Результати представлено в табл. 4. Таблиця 4 Активність РФ-кінази та вміст флавінів в культуральній рідині рекомбінантних штамів С. famata АТСС 20849, що містять FMN1 D. hansenii під контролем TEF1 промотора Штам АТСС 20849 2 6 7 11 13 16 Активність РФ-кінази, мкмоль ´ 10-5 / хв ´ мг білка 43,9 241,4 238,9 234,0 287,7 390,0 299,9 Отримані рекомбінантні штами мають в 5-9 разів вищу активність РФ-кінази у порівнянні з реципієнтним штамом С. famata АТСС 20849 та приблизно у 20 разів вищу, ніж у штама L20105. В культуральній рідині отриманих рекомбінантних штамів вміст ФМН вищий, ніж у реципієнтного штама С. famata АТСС 20849. Відсотковий вміст ФМН від загального вмісту флавінів становить 4070%, в той час як у реципієнтного штаму С. famata АТСС 20849 - лише 10%. Джерела інформації: 1. Березовский В.М. Химия витаминов. - М.: Пищевая промышленность, 1973. - 632 с. 2. Stahmann K.P. et al. Microbiol. and Biotechnol. - 2000. - Vol. 53, N5 - P. 509-516. Флавіни культуральної рідини, мг/л Сумарна кількість %ФМН ФМН флавінів 2,67 28,47 10 5,33 13,33 44 17,8 30,24 59 8,0 16,9 48 5,3 8,9 60 24,9 36,50 69 8,9 22,2 40 3. Сибірний Α.Α. і співавт. Мікробний синтез флавінів, Київ: Наукова думка, 2006. - 192 с. 4. Патент США №5.514574, опубл. 7 травня 1996. 5. Manstein D.J. and Pai E.F.J. Biol. Chem. 1986. - Vol. 261, №34. - P. 16169-16173. 6. Sambrook J., Fritsh E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 1989. 7. Voronovsky Α.Α. et al. // FEMS Yeast Research. - 2002. - Vol. 2. - P. 381-388. 8. Wach A., Pick H., Philipsen P. In: Molecular Genetics of Yeast. A Practical Approach (Johnston, J.R., Ed.), IRL Press, Oxford. - 1994. - P. 1-16. 9 Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 87684 Підписне 10 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601