Штам дріжджів candida famata imb y-5034 – продуцент рибофлавіну (вітаміну в2)

Штам дріжджів Candida famata - продуцент рибофлавіну (вітаміну В2), депонований в Депозитарії Інституту мікробіології та вірусології НАН України за № ІMB Y-5034, який має високу флавіногенну активність і призначений для мікробіологічного отримання вітаміну В2. (19) (21) u200807350 (22) 28.05.2008 (24) 10.10.2008 (46) 10.10.2008, Бюл.№ 19, 2008 р. (72) СИБІРНИЙ АНДРІЙ АНДРІЙОВИЧ, U A, ДМИТРУК КОСТЯНТИН ВАСИЛЬОВИЧ, UA, ФЕДОРОВИЧ ДАРІЯ ВАСИЛІВН А, U A 3 36164 колонії віком 7 діб округлі, діаметром 2-3 мм, профіль припіднятий, краї рівні, поверхня гладка блискуча, жовтува того кольору. На скошеному суслоагарі 3-х добовий штрих гладкий однорідний блискучий, жовтуватого забарвлення. Клітини штаму С. famata ІMB Y-5034 асимілюють сахарозу, глюкозу, фр уктозу, галактозу, целобіозу, крохмаль, янтарну кислоту, глутамінову . кислоту, сорбітол, лактозу, лактат, манніт, гліцерин; слабо ростуть на мальтозі, арабінозі, інозиті, етанолі, маннозі, ксилозі, рамнозі, ксиліті, дульциті, рафінозі, меліцитозі, трегалозі, сорбозі, проте не використовують яблучн у кислоту. Клітини сконструйованого штаму не ферментують сахарозу, глюкозу, галактозу, ксилозу, лактозу, крохмаль, трегалозу, рафінозу, целобіозу та меліцитозу. Як джерело азоту штам С. famata ІMB Y-5034 використовує сульфат амонію, диамоній фосфа т, сечовин у, але не нітрат натрію. Штам С. famata 1MB Y-5034 належить до облігатних аеробів. Оптимум температури становить 30°С, оптимум рН становить 6,5-9,0. Штам зберігається на агаризованому суслоагарі в холодильнику. Клонується двічі на рік, на 45 день вирощування відсівають 3-4 клони з високою флавіногенною активністю. Для конструювання штаму С. famata ІMB Y5034 використовують такі методи: мутагенез за допомогою УФ-променів, N-метил-N'-нітро-Nнітрозогуанідину або етилметансульфонату [7]. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), конструювання рекомбінантних плазмід, виділення плазмід з Escherichia соli, рестрикційний аналіз, електрофорез в агарозному гелі, трансформація Е. coli методом електропорації, описані в [8]. Трансформацію С. famata проводять, як описано в [9]. Виділення сумарної ДНК з трансформантів С. famata проводять як для S. cerevisiae [10]. Вміст РФ визначають флуориметрично на приладі ЕФ-3М. Отримання продуцента РФ С. famata IMB Y5034 та його характеристика ілюструються графічними матеріалами. На Фіг. 1 зображено продукцію РФ штамами С. famata, отриманими на різних етапах селекції, де на осі абсцис позначено номер етапу селекції, а на осі ординат - вміст РФ у культуральній рідині. На Фіг. 2 зображена лінійна схема плазміди рТb (4.0 т.п.н.), де відкриту рамку трансляції гену ble Staphylococcus aureus позначено товстою сірою лінією; промотор власного гену TEF1 - товстим білим відрізком; бактерійна послідовність pUC57 - тонкою лінією; хвилястою лінією позначено хромосомну ДНК інсерційного штаму, товстою посмугованою лінією позначено ген SEF1; скорочення сайтів рестрикції: Н, HindIII; Sp, SphI; P, PstI; Sl, SalI; Xb, XbaI; B, BamHI; Sm, SmaI; K, KpnI; Sc, SacI; R, EcoRI. На Фіг. 3 зображено зміни продуктивності флавіногенезу вихідного штаму С. famata AF4 , IMB Y-5033 та IMB Y-5034 протягом 3 днів вирощування, де на осі абсцис відкладений час вирощування, а на осі ординат - продуктивність флавіногенезу (кількість утвореного РФ в перерахунку на мг біомаси). 4 Штам дріжджів С. famata IMB Y-5034 - продуцент РФ з високою стабільністю за ознакою „надсинтез РФ" отримують у декілька етапів. Етап 1. Селекція штамів з підвищеною флавіногенною активністю Вихідним штамом для селекції є колекційний штам з колишньої Всесоюзної (тепер Всеросійської) колекції мікроорганізмів ВКМ У-9. Відбір флавіногенного штаму методами класичної селекції включає 6 етапів. На першому, третьому, четвертому та п'ятому етапах селекції як мутаген використовують ультрафіолет, на другому - нітрозогуанідин, а на шостому - етилметансульфонат. Доза мутагену підбирається таким чином, аби забезпечити 10 % виживання клітин. На першому етапі селекції використовують структурний аналог РФ - 7-метил-8-трифторметил10(1’-рибітил)-ізоалоксазин (МТРІ). Він гальмує ріст штаму ВКМ У-9 лише за наявності в середовищі високих концентрацій йонів сульфату або фосфа ту. Тому селекцію резистентних мутантів ведуть в середовищі з МТРІ (200 мкг/мл) та 0,6 М K2SO4 . Найбільш флавіногенний мутант, що нагромаджував у колбах Ерленмейєра об'ємом 50 мл в середовищі Беркгольдера з оптимальним для росту вмістом заліза до 35 мкг РФ/мл (Фіг. 1), використовують для подальшої селекції. На другому етапі як селекційний агент використовують 8-азагуанін. Відбирають мутанти, резистентні до 8-азагуаніну (200 мкг/мл) і перевіряють їх на здатність до надсинтезу РФ в середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза. Найкращий штам, що утворював до 78 мкг РФ/мл (Фіг. 1), використовують для селекції на третьому етапі. У цьому випадку селекційним фактором служив 6азаурацил (200 мкг/мл). Мутант, стійкий до 6азаурацилу, що нагромаджує до 176 мг РФ/мл (Фіг. 1), використовують як вихідний на четвертому етапі. Після УФ мутагенезу, відбирають найбільш флавіногенні мутанти, що стійкі до 2-діазо-5-оксоL-норлейцину (80 мкг/мл). Найкращим виявився штам, що синтезує до 380 мкг РФ/мл (Фіг. 1). Нами виявлено, що ріст флавіногенних мутантів С. famata пригнічується гуанозином. Тому на п'ятому етапі отримують флавіногенні мутанти, стійкі до інгібуючої дії на ріст гуанозину (300 мкг/мл). В результаті відібрано найкращий штам, що синтезує до 450 мкг РФ/мл (Фіг. 1). Останній етап класичної селекції базується на нашому спостереженні, що флавіногенні мутанти С. famata практично не здатні до надсинтезу РФ при культивуванні в забуференому середовищі при рН 6,8. Оброблені етилметансульфонатом клітини флавіногенного мутанта, отриманого на попередньому етапі селекції, висівають на агаризоване середовище Беркгольдера, що містить 0,1 М К-фосфатний буфер, рН 6,8 й і відбирають найжовтіші колонії. Їх флавіногенну активність перевіряють у незабуференому середовищі Беркгольдера. Найбільш флавіногенним серед 87 перевірених (жовтих на забуференому середовищі колоній) виявився штам AF4, що нагромаджує за 4 доби культивування на круговій качалці при 200 об/хв до 688 мг РФ/мл (Фіг. 1). 5 36164 Протягом кожного етапу селекції перевіряють здатність відібраних фла віногенних мутантів до росту в середовищі з етанолом як єдиним джерелом вуглецю і енергії і відбирають для подальшого поліпшення лише штами, які здатні утилізувати етанол. Це дозволяє уникнути небезпеки реверсії флавіногенних штамів за ознакою здатності рости на етанолі, що корелює у промислового продуцента РФ, штаму АТСС 20849,. з втратою здатності до надпродукції вітаміну В2 . Етап 2. Одержання рекомбінантних штамів С. famafa з додатковою копією гену SEF1. Для стабілізації отриманого штаму AF4 за ознакою „надсинтез РФ" в його геном вводять додаткову копію гену SEF1 D. hansenii. Ген SEF1 кодує транскрипційний фактор, залучений у регуляцію біосинтезу РФ у дріжджів [11]. Для ведення в геном мутанта AF4 додаткової копії гену SEF1 D. hansenii його трансформують плазмідою pTDhSEF1 (Фіг. 2). Перевіряють здатність до надсинтезу РФ в отриманих трансформантів. Найвищу флавіногенну активність виявлено у штаму С. famata IMB Y-5034, який нагромаджує при вирощуванні в простому цукрово-мінеральному середовищі більше 1 г РФ/л. 6 Штам дріжджів С. famata IMB Y-5034 пройшов лабораторне випробування. Етап 3. Перевірка стабільності сконструйованого штаму та його здатності до надсинтезу РФ. Для перевірки стабільності штами С. famata IMB Y-5033 (прототип), AF4 та IMB Y-5034 висівають на чашки з середовищем YPD, через 1 добу засівають у 50 мл цього ж середовища в колби об'ємом 100 мл. Після вирощування протягом 1,5 доби клітини осаджують центрифугуванням, двічі промивають стерильною дистильованою водою і висівають на синтетичне середовище Беркгольдера, що містить 1 % етанол як джерело вуглецю, в кількості 15х106 клітин на чашку. Через 14 днів підраховують кількість колоній на чашці і розраховують частоту реверсії. Як видно з таблиці 1, сконструйований штам С. famata IMB Y-5034 характеризується високою стабільністю: після 14 днів культивування він зовсім не вищеплює нефлавіногенних клонів, здатних до утворення великих за розміром колоній при рості на середовищі з етанолом. Частота реверсії для раніше отриманого штаму С. famata IMB Y-5033 становить 13,8х10-6 [6], а штаму АF4 - 0,4 х10-6. Таблиця 1. Частота появи клонів, здатних до росту на етанолі у штамів С. famata AF4, IMB У-5033 та IMB Y-5034. Штам С. famata AF4 С. famata IMB Y-5033 С. famata IMB Y-5034 Для перевірки здатності до синтезу РФ штам С. famata IMB Y-5034 вирощують на чашці Петрі на агаризованому середовищі Беркгольдера із 0,5 % дріжджовим екстрактом при 30°С протягом 1 доби. Отриману культур у висівають в колби (300 мл) із рідким середовищем Беркгольдера, Частота реверсії 0,4х10-6 13,8х10-6 що містить 0,5 % дріжджовий екстракт (50 мл в колбі), витримують протягом 1-5 діб на круговій качалці (швидкість обертання 200 об./хв) при 28°С, після чого визначають вміст РФ в культуральній рідині. Результати досліджень наведені в табл. 2. Таблиця 2. Динаміка продукування РФ штамом С. famata ІMB Y-5034. Час росту, діб 1 2 3 4 5 За даними табл. 2 РФ інтенсивно синтезується на 2 добу культивування, максимальний вихід продукту спостерігається на 5 добу. Продуктивність флавіногенезу (кількість утвореного РФ в перерахунку на одиницю біомаси) сконструйованого штаму С. famata ІMB Y-5034 на 3 добу культивування у 3 рази вища, ніж у штаму С. famata AF4 та ІMB Y-5033 (Фіг.2). Вміст РФ, мг/л 20,9±1,9 776,7±67,2 1108,2±95,0 1155,9±99,6 1210,4±105,1 Продукція РФ сконструйованим штамом С. famata ІMB Y-5034 та штамами С. famata AF4 та ІMB Y-5033, вирощеними на середовищах різного складу (середовище Беркгольдера (СБ) і СБ + дріжджовий екстракт (СБ+ДЕ), представлена у табл. 3. 7 36164 8 Таблиця 3. Продукція РФ штамами Candida famata AF4, 1 MB Y-5033 та 1MB Y-5034, вирощеними в колбах у середовища х різного складу. Штам AF4 ІMB Y-5033 ІMB Y-5034 Вміст РФ (мг/л) в к ультуральному середовищі СБ СБ+ДЕ 107,7±76,2 528,6±48,1 177,0±12,1 523,5±40,1 277,1±28,2 1210,4±105,1 За даними табл. 3 штам С. famata ІMB Y-5034 відрізняється від штаму AF4 та ІMB Y-5033 більшою флавіногенною активністю на обидвох використаних середовищах. За умов культивування у колбах на круговій качалці (200 об/хв) у середовищі, що містило 2 % глюкози, 1 % пептону та 0,5 % дріжджового екстракту протягом 4 діб запропонований штам нагромаджує більше 1,2 г РФ/л. Сконструйований штам С. famata ІMB Y-5034, завдяки підвищеній флавіногенній активності та високій стабільності за ознакою „надсинтез РФ". може бути використаний у виробництві як ефективний продуцент РФ (вітаміну В2). Джерела інформації: 1. Stahmann K.P. et al. Microbiol. and Biotechnol. - 2000. - Vol. 53, N 5 - P. 509-516. 2 Патент США № 009822, опубл 15.12.1988. 3. Патент США № 811234, опубл. 20.12.1985. 4. Патент США № 5164303, опубл. 17.11.1992. 5. Патент США № 5231007, опубл. 27.07.1993. 6. Заявка на патент України № а 2008 03778 від 25.03.2008 7. Adelberg et al. // Biochem.Biophys.Res.Communs. - 1965. - Vol. l8, № 5. - P.788-795. 8. Sambrook J., Fritsh E. F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 1989. 9. Voronovsky A.A. et al. // FEMS Yeast Research. - 2002. - Vol. 2. - P. 381-388. 10. Wach A., Pick H., Philipsen P. In: Molecular Genetics of Yeast. A Practical Approach (Johnston, J.R., Ed.), IRL Press, Oxford. - 1994. - P. 1-16. 11. Dmytruk K.V. et al. // Curr Genet. - 2006. Vol. 50, N 3. - P. 183-191. 9 Комп’ютерна в ерстка І.Скворцов а 36164 Підписне 10 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601