Спосіб зберігання мікробної суспензії staphylococcus aureus для проведення фагоцитарної реакції

Реферат: Спосіб зберігання мікробної суспензії Staphylococcus aureus для проведення фагоцитарної реакції передбачає інактивацію добової культури нагріванням на водяній бані при 80…100 °C протягом години і послідуюче охолодження до 4 °C. Охолоджену суспензію занурюють у рідкий азот. UA 88534 U (54) СПОСІБ ЗБЕРІГАННЯ МІКРОБНОЇ СУСПЕНЗІЇ STAPHYLOCOCCUS AUREUS ДЛЯ ПРОВЕДЕННЯ ФАГОЦИТАРНОЇ РЕАКЦІЇ UA 88534 U UA 88534 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі кріобіології і кріомедицини, і може бути використана в клінічній та ветеринарній імунології. При визначенні фагоцитарної активності нейтрофілів або моноцитів як об'єкт фагоцитозу головним чином використовують свіжозмиту добову культуру Staphylococcus aureus штаму № 209 або Staphilococcus epidermidis штаму № 9198 [1]. При цьому постає проблема частого приготування та зберігання суспензії живих тест-мікробів [1]. Відомий спосіб зберігання мікробної суспензії Staphylococcus aureus при 4 °C [2]. Згідно зі способом, добову культуру Staphylococcus aureus штаму № 209 на агарі, змиту фізіологічним розчином, інактивують нагріванням на водяній бані протягом години при 80…100 °C, після чого поміщають до холодильної камери та зберігають при 4 °C [2]. Недоліком цього способу є короткий термін (до 1 тижня) зберігання мікробної суспензії [2], що потребує частого приготування суспензії тест-мікробів. В основу корисної моделі поставлена задача створити такий спосіб зберігання мікробної суспензії Staphylococcus aureus для проведення фагоцитарної реакції, який би дозволив подовжити термін її придатності. Поставлена задача вирішується тим, що у способі зберігання мікробної суспензії Staphylococcus aureus, який передбачає інактивацію добової культури нагріванням на водяній бані при 80…100 °C протягом години і послідуюче охолодження до 4 °C, згідно з корисною моделлю, охолоджену суспензію занурюють у рідкий азот. Заявлений спосіб дозволяє зберігати готову для проведення фагоцитарної реакції мікробну суспензію не менше ніж 70 діб, що виключає необхідність частого приготування мікробної суспензії. Спосіб здійснюється таким чином: Добову культуру Staphylococcus aureus на агарі змивають фізіологічним розчином, після чого проводять інактивацію мікробів шляхом нагрівання на водяній бані при 80…100 °C протягом години. Отриману суспензію охолоджують в холодильній камері до 4 °C, після чого занурюють у рідкий азот, де зберігають до моменту використання. Спосіб пояснюється прикладами. Приклад 1 Добову культуру Staphylococcus aureus штаму № 209 на агарі змивали фізіологічним розчином, після чого проводили інактивацію мікробів шляхом нагрівання на водяній бані при 80…100 °C протягом години. Концентрацію мікробних тіл регулювали згідно зі стандартом мутності (2 млрд мікробних тіл/мл). Отриману суспензію охолоджували в холодильній камері до 4 °C, після чого занурювали у рідкий азот та зберігали протягом 35 і 70 діб. Для проведення реакції фагоцитозу використовували концентрат лейкоцитів донорської крові людини групи А (II), виділений седиментацією еритроцитів декстраном [3]. В 96-лунковий планшет для імунологічного тестування вносили 100 мкл концентрату лейкоцитів та 20 мкл мікробної суспензії Staphylococcus aureus, яку готували описаним вище способом. Для порівняльної серії експериментів як об'єкт фагоцитозу використовували суспензію добової інактивованої культури Staphylococcus aureus штаму № 209 на фізіологічному розчині, що зберігалась при 4 °C згідно з найближчим аналогом, а також свіжоприготовану мікробну суспензію (контроль). Лейкоцити з мікробами інкубували у повітряному термостаті при +37 °C протягом 45 та 120 хв. Через 45 та 120 хв. інкубації суміш перемішували та виготовляли мазки, які фіксували за Май-Грюнвальдом та фарбували за Романовським. Фарбовані мазки аналізували з допомогою світлового мікроскопу під імерсією. Фагоцитарну активність фагоцитуючих лейкоцитів (нейтрофілів) оцінювали за наступними показниками: відсоток фагоцитуючих нейтрофілів - фагоцитарний індекс (ФІ), середня кількість мікробних тіл на один нейтрофіл - фагоцитарне число (ФЧ) після 45 і 120 хв. інкубації, а також індекс завершеності фагоцитозу (ІЗФ) - співвідношення фагоцитарного числа після 45 хв. інкубації до фагоцитарного числа через 120 хв. інкубації, що характеризує переварювальну активність нейтрофілів. Встановлено, що після 70 діб зберігання мікробної суспензії при 4 °C, згідно з найближчим аналогом, фагоцитарні показники нейтрофілів зменшувалися, особливо ФЧ, який до зберігання складав 7,14 та 5,58 абс. од., а після зберігання 2,78 та 2,47 абс. од. після 45 та 120 хв. інкубації, відповідно (Таблиці). При використанні як об'єкт фагоцитозу мікробної суспензії, яка була занурена у рідкий азот та зберігалася 35 і 70 діб, фагоцитарні показники нейтрофілів, на відміну від найближчого аналога, залишалися на рівні контрольних значень (Таблиці). Приклад 2 1 UA 88534 U 5 10 15 20 Визначали вплив швидкості заморожування на здатність інактивованої мікробної суспензії Staphylococcus aureus, що зберігалася у рідкому азоті, викликати фагоцитарну реакцію. Приготовану та інактивовану описаним вище способом мікробну суспензію Staphylococcus aureus штаму № 209 повільно охолоджували з допомогою програмного заморожувача ЗП 10, виготовленого СКТБ ОП ІПКіК НАНУ, зі швидкістю 2 °C/хв до -100 °C, після чого занурювали у рідкий азот і зберігали протягом 35 і 70 діб. Виділення лейкоцитів та фагоцитарну реакцію проводили методами, описаними у Прикладі 1. Результати дослідження показали, що при використанні в якості об'єкту фагоцитозу мікробної суспензії Staphylococcus aureus, яка була повільно заморожена (2 °C/хв) до -100 °C та зберігалася у рідкому азоті на протязі 35 та 70 діб, фагоцитарні показники нейтрофілів зменшувалися у порівнянні з контролем та заявленим способом, де суспензію заморожували з високою швидкістю (занурення у рідкий азот) (Табл.). Джерела інформації: 1. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - С. 310-311. 2. Подопригора Г.И., Андреев В.Н. Современные методы изучения фагоцитарной активности лейкоцитов in vitro // Жypн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 1976. № 1. - С. 19-25 (найближчий аналог). 3. Гришина В.В., Тимохина Е.В., Андреева Л.Ю. Система сбора и фракционирования стволовых клеток пуповинной крови // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2004. - Т.3, № 6. - С. 50-54. Таблиця Фагоцитарні показники нейтрофілів в залежності від способу зберігання інактивованої нагріванням добової культури Staphylococcus aureus 35 діб зберігання суспензії 70 діб зберігання суспензії Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Показник Заморожува Заморожува фагоцитар ння зі ння зі ної Контроль 4 °C швидкістю Занурення 4 °C швидкістю Занурення активності (натив) (найближч 2 °C/хв до - до рідкого (найближчи 2 °C/хв до - до рідкого нейтрофілі ий аналог) 100 °C та азоту й аналог) 100 °C та азоту в зберігання у зберігання у рідкому азоті рідкому азоті ФІ, % 49,5±1,76 54±1,15 44,3±0,88 51,7±1,20 38±1,15* 47,3±1,45 55,3±0,88** (45 хв.) ФІ, % 45,17±1,0 53±2,08 42,7±1,45 50±1,73 36±1,00* 45±1,53 51,7±3,92** (120 хв.) 9 ФЧ, абс. 7,14±0,39 7,45±0,04 5,51±0,18 7,89±0,17 2,78±0,06* 4,5±0,12* 7,18±0,19** од (45 хв.) ФЧ, абс. од. (120 5,58±0,26 5,85±0,083 4,73±0,09 6,15±0,20 2,47±0,11* 4,3±0,04 5,81±0,32** хв.) ІЗФ 1,28±0,05 1,27±0,02 1,16±0,02 1,29±0,04 1,13±0,03 1,04±0,02* 1,24±0,05 Дані представлені у вигляді (М ± стандартна похибка) * - у порівнянні з контролем (натив) ** - у порівнянні з найближчим аналогом 25 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Спосіб зберігання мікробної суспензії Staphylococcus aureus для проведення фагоцитарної реакції, який передбачає інактивацію добової культури нагріванням на водяній бані при 80…100 °C протягом години і послідуюче охолодження до 4 °C, який відрізняється тим, що охолоджену суспензію занурюють у рідкий азот. 2 UA 88534 U Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3