Спосіб визначення патогенності staphylococcus aureus за вмістом тейхоєвих кислот

Реферат: Спосіб визначення патогенності штамів Staphylococcus aureus, який включає визначення видових та штамових ознак та їх кількісний вимір. Як ознаку патогенності оцінюють вміст тейхоєвих кислот. Виділення тейхоєвих кислот клітин S. aureus проводять додаванням до змивів агарових культур 10 %-ої трихлороцтової кислоти з наступним осадженням холодним етанолом і відмиванням ацетоном, етанолом і ефіром в ексикаторі; вміст тейхоєвих кислот визначають за оптичною щільністю при довжині хвилі λ=254 нм. Отримані результати порівнюють із значеннями контрольної групи і при перевищенні отриманих показників у порівнянні з контролем вважають даний штам патогенним. UA 88794 U (12) UA 88794 U UA 88794 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до медичної мікробіології, і може бути використана для встановлення патогенності штамів Staphylococcus aureus (S. aureus) за вмістом тейхоєвих кислот. Під патогенністю бактерій розуміють здатність викликати захворювання. Це видова полідетермінантна ознака збудника, що позначає його потенційну можливість викликати інфекційний процес, тобто проникати в організм, розмножуватися в ньому і чинити на нього шкідливу дію. Основні фактори патогенності поділяють на три групи: фактори, що визначають взаємодію мікроорганізму з епітелієм слизових оболонок; фактори, що сприяють стійкості мікроорганізму до гуморального та клітинного захисту макроорганізму та їх здатність розмножуватись in vivo; здатність продукувати токсини і токсичні продукти, викликаючи власне патологічний процес. У практичній медицині відомо декілька способів визначення патогенності виділених мікроорганізмів. Зокрема, визначення таких факторів патогенності, як адгезивна активність бактерій, цитолітична і гемолітична активність, продукція ними протеази, гіалуронідази, а також деградація бактеріями таких факторів неспецифічної резистентності організму, як лізоцим, комплемент і інтерферон. Так, наприклад, відомий спосіб визначення патогенних мікроорганізмів Staphylococcus epidermidis, виділених зі сперми. Суть способу полягає в наступному: проби мікроорганізмів, виділені від донорів, інкубують зі сперміном або спермідином в концентрації 0,02-0,06 мг/мл з подальшим встановленням кількості мікроорганізмів, що вижили. Далі порівнюють оптичну щільність дослідної проби і контролю. При перевищенні її у порівнянні з контролем вважають даний штам патогенним. Перевага запропонованого способу в тому, що встановлення шкідливого впливу сперміну і спермідину на виділені мікроорганізми підвищує достовірність визначення їх патогенності. Крім того, для визначення кількісного числа бактеріальних клітин, які вижили після інкубації зі сперміном і спермідином, застосовують фотоелектрокалориметр КФК-2, що робить методику більш чутливою, крім того, досягається більш висока точність і відтворюваність результатів [Пат. № 2251691, RU, МПК G01N33/15, C12Q1/02. Способ определения патогенности микроорганизмов Staphylococcus epidermidis, выделенных из спермы / Бойко О.В., Николаев А.А., Плосконос М.В. З. № 2003106775/15; заявл. 11.03.2003; опубл. 10.05.2005]. Відомий також спосіб визначення патогенності мікроорганізмів за антилізоцимною активністю. Факт виявлення цієї властивості у Staphylococcus aureus і встановлення вираженості цієї ознаки у інших видів понад 6 мкг/мл, дозволяє визначити мікроорганізм, який як правило, є етіологічними агентом у розвитку інфекції. Спосіб здійснюють шляхом вирощування досліджуваної культури в рідкому поживному середовищі, відділення супернатанта, інкубації його з лізоцимом та додавання отриманої суміші до суспензії тест-культури Micrococcus lysodeikticus, попередньо обробленої трилоном Б. Далі проводять вимірювання оптичної щільності отриманої суміші. Про рівень антилізоцимної активності (АЛА) судять за ступенем лізису суспензії тест-культури мікрококів, який розраховують за формулою [Пат. № 2126051, RU, МПК C12Q1/02. Способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов / Елагина Н.Н., Иванов Ю.Б., Черкасов С.В.; Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН. - 3. № 97101325/13; заявл. 27.01.1997; опубл. 10.02.1999]. Відомий спосіб визначення патогенних стафілококів за плазмокоагулюючою активністю. Плазмокоагулююча активність є одним з основних ознак патогенності стафілококів (Staphylococcus aureus). Спосіб визначення патогенних стафілококів за плазмокоагулюючою активністю передбачає внесення 12-годинної культури стафілокока в плазму, розведену ізотонічним розчином хлориду натрію, інкубацію мікробної суспензії при температурі 37 °C впродовж 5 годин та реєстрацію електричного опору мікробної суспензії з 3-ої до 5-ої години інкубації, причому при показниках опору розчину 64-84 кОм роблять висновок про патогенність стафілокока за наявності плазмокоагулюючої активності [Пат. № 2332461, RU, МПК C12Q1/14, C12R1/44. Способ определения патогенных стафилококков по плазмокоагулирующей активности / Ананьев В.Н., Козлов Л.Б., Сперанская Е.В. и др. - З. № 2006139189/13; заявл. 08.11.2006; опубл. 27.08.2008]. Даний спосіб визначення патогенності Staphylococcus aureus є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю і результатом, який може бути досягнутим, тому його вибрано за прототип. В основу корисної моделі поставлена задача розширення арсеналу способів визначення патогенності Staphylococcus aureus. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі визначення патогенності штамів Staphylococcus aureus, який включає визначення видових та штамових ознак та їх кількісний 1 UA 88794 U 5 10 15 20 25 30 35 40 вимір, згідно з корисною моделлю, як ознаку патогенності оцінюють вміст тейхоєвих кислот, виділення тейхоєвих кислот клітин Staphylococcus aureus проводять додаванням до змивів агарових культур 10 %-ої трихлороцтової кислоти з наступним осадженням холодним етанолом і відмиванням ацетоном, етанолом і ефіром в ексикаторі; вміст тейхоєвих кислот визначають за оптичною щільністю при довжині хвилі λ = 254 нм; отримані результати порівнюють із значеннями контрольної групи і при перевищенні отриманих показників у порівнянні з контролем вважають даний штам патогенним. Технічний ефект корисної моделі полягає в тому, що тейхоєві кислоти складають значну частину клітинної стінки грампозитивних бактерій і їх кількість може досягати 60 % від її ваги. Вони ковалентно пов'язані з пептидогліканами, є невід'ємною частиною клітинної стінки і, таким чином, знаходяться в тісному зв'язку з усіма процесами, що відбуваються за її участі. До них належать - зростання і ділення клітин, зв'язування і резервування катіонів, необхідних для функціонування мембранних ферментів, процеси міжклітинного розпізнавання, рецепція фагів, патогенність. Тейхоєві кислоти та інші аніонні з'єднання клітинної стінки вносять істотний внесок у формування структури поліелектролітного гелю і визначають її механічні властивості. Спосіб виконують наступним чином: як ознаку патогенності оцінюють вміст тейхоєвих кислот. Виділення тейхоєвих кислот клітин S. aureus проводять додаванням до змивів агарових культур 10 %-ої трихлороцтової кислоти з наступним осадженням холодним етанолом і відмиванням ацетоном, етанолом і ефіром в ексикаторі. Вміст тейхоєвих кислот визначають за оптичною щільністю на СФ-46 при довжині хвилі λ = 254 нм. Отримані результати порівнюють із значеннями контрольної групи (референтні штами). При перевищенні отриманих показників (більше 0,161 од. ОЩ) у порівнянні з контролем вважають даний штам патогенним. Ефективність способу доказана експериментально. В основу способу покладено метод екстракції тейхоєвих кислот клітин S. aureus, яку проводили додаванням до змивів агарових культур 10 %-ої трихлороцтової кислоти, далі осаджували холодним етанолом, відмивали холодним ацетоном, етанолом і ефіром в ексикаторі. Вміст тейхоєвих кислот визначали за оптичною щільністю на СФ-46 при довжині хвилі λ=254 нм. Дослідження вмісту тейхоєвих кислот проводили на 55 штамах S. aureus, які були виділені від хворих із різними гнійно-запальними захворюваннями, в якості контрольної групи використовували 4 референтні штами АТСС 25923. Виділення тейхоєвих кислот бактеріальних клітин проводили наступним методом: змиви добових агарових культур S. aureus екстрагували додаванням 5 мл 10 %-ої трихлороцтової кислоти при 4 °C на льоду впродовж 16 год. Суспензію центрифугували при 3000 об/хв. впродовж 20 хв., знову додавали розчин 10 %-ої трихлороцтової кислоти на 24 год. при 4 °C. Для подальшої екстракції додавали холодний етанол та витримували впродовж 24 год. при 4 °C. Після цього знову центрифугували та осаджували додаванням розчину 10 %-ої трихлороцтової кислоти та холодного етанолу при 4 °C протягом 24 год. Наступним етапом було відмивання холодним ацетоном, етанолом і ефіром в ексикаторі. Осадження проводили повільно при 4 °C впродовж 2-х діб. Вміст тейхоєвих кислот визначали за оптичною щільністю на СФ-46 при довжині хвилі 254 нм. Результати дослідження представлені у таблиці 1. Таблиця 1 Середні показники вмісту тейхоєвих кислот клітинної стінки S. aureus № п/п 1. 2. Групи досліджуваних штамів S. aureus клінічні ізоляти референтні штами АТСС 25923 Вміст тейхоєвих кислот, (од. ОЩ) 0,373±0,016* 0,147±0,014* Примітка: * - різниця достовірна р