Спосіб індукції калюсогенезу у вівсу

Реферат: UA 89430 U UA 89430 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології, селекції, рослинництві, зокрема для розмноження і отримання нових форм і розсади цінних селекційних матеріалів. Овес - рід Avena включає близько 70 видів, із них - 5 культурних, інші бур'яни і дикі. Серед такого великого різноманіття видів вівса практичне значення мають лише два - овес посівний (Avena sativa L.) та овес візантійський (Avena byzantina C Koch.). На піщаних ґрунтах вирощують ще овес піщаний (Avena strigosa). Інтенсифікація селекційного процесу та створення нових технологічних схем можливе лише з використанням біотехнологічної ланки. Клітинна селекція є одним із напрямів біотехнології, яка дозволяє отримати новий вихідний матеріал, виключаючи систему багаторазових схрещувань та додаткових грошових затрат. Калюсна тканина цінна в подальшому селекційному процесі тим, що з неї можна регенерувати рослини, як генетично-ідентичні материнській рослині так і з новими якісними ознаками. Для отримання такого матеріалу необхідно підбирати умови (зокрема склад живильного середовища) для індукції стимулювання морфогенезу калюсної біомаси. Відомим і найбільш близьким до корисної моделі є особливості отримання калюсної тканини і рослин-регенерантів ячмінно-житніх і ячмінно-пшеничних гібридів (Першина Л.А., Шумный В.К. Особенности каллусной ткани и растений-регенерантов ячменно-ржаных и ячменно-пшеничных гибридов. - М.: Наука, 1986. - С. - 176-178). Даний спосіб базується на тому, що як експланти для отримання калюсних глобул використовують молоді колоски. Експланти вилучали із бокових пагонів в фазі трьох-чотирьох листочків. Стерилізували матеріал етанолом - 70 % упродовж 45 хвилин та висаджували на живильне середовище за прописом Гамборга і Евелега з додаванням БАП - 0,5-0,8 мг/л, 2,4 - Д - 0,8-1,0 мг/л, кінетину - 0,8-1,0 мг/л, ІОК - 1,5-2,0 мг/л, цукрози - 20,0 г/л і проводили культивування в темряві у термостаті протягом трьох тижнів, а потім на світлі при температурі 24±2 °С і 16 годинному фотоперіоді. Маса калюсних глобул становила - 1,6-1,8 г. Відомий і пропонований способи мають спільні ознаки: приготування агаризованого живильного середовища, умови культивування в темряві та на світлі за температури 24±2 °С і 16 годинному фотоперіоді. Проте, у відомому способі отримання калюсної тканини і рослин-регенерантів ячмінножитніх і ячмінно-пшеничних гібридів пропоноване живильне середовище забезпечує малий відсоток утворення калюсних структур у вівсу, потребує довшого терміну культивування у темряві в термостаті. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб індукції калюсогенезу, що дасть можливість отримати калюс у вівсу використовуючи in vitro експланти, підібрати і модифікувати склад живильного середовища, зменшити період культивування в темряві до 2 тижнів, прискорити отримання калюсних глобул. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі використовують бокові пагони молодих колосків, із яких в фазі трьох-чотирьох листочків вилучають експланти. Для отримання стерильного матеріалу використовують розчин 70 % етанолу за експозиції 45 хвилин. Експланти висаджують на модифіковане живильне середовище Гамборга і Евелега з додаванням БАП 0,5-0,8 мг/л, 2,4 - Д - 1,0-0,8 мг/л, кінетину - 0,8-1,0 мг/л, ІОК - 1,5-2,0 мг/л, цукрози - 20,0 г/л. Матеріал спочатку ставлять у термостат на 3 тижні, а потім на світлі культивують при температурі 24±2 °С і 16 годинному фотоперіоді. Маса калюсних глобул становить - 1,6-1,8 г. Запропонований спосіб індукції калюсогенезу у вівсі здійснюється таким чином: на сегментах черешків та листових пластинках вівсу роблять насічки та висаджують їх на модифіковане живильне середовище за прописом Мурасіге і Скуга з додаванням БАП - 0,8 мг/л, 2,4 - Д - 0,5 мг/л, кінетину - 0,5 мг/л, ІОК - 0,5 мг/л, НОК - 0,5 мг/л, гіберелової кислоти - 0,5 мг/л, цукрози 30,0 г/л. Культивування проводять у темряві в термостаті упродовж 2 тижнів, а потім на світлі при температурі 24±2 °С і 16 годинному фотоперіоді. Маса калюсних глобул становить - 2,1 г. Новими, відмінними від існуючого прототипу, ознаками є: - використання живильного середовища за прописом Мурасіге і Скуга; - експланти - сегменти черешків, листові пластинки; - використання гіберелової кислоти - 0,5 мг/л; - використання - НОК - 0,5 мг/л; - культивування у темряві в термостаті упродовж 2 тижнів; - зниження концентрації кінетину - 0,5 мг/л; - зниження концентрації ІОК - 0,5 мг/л; - зниження концентрації 2,4 - Д - 0,5 мг/л; - збільшення концентрації цукрози - 30,0 г/л. 1 UA 89430 U 5 10 15 20 25 Відмінні від прототипу ознаки, при взаємодії з відомими дозволяють, отримати калюс у вівсі за використання in vitro експлантів, підібрати і модифікувати склад живильного середовища, скоротити строки культивування, пришвидшити отримання калюсних глобул. Ефективність нового способу індукції калюсогенезу у вівсі в культурі in vitro вивчали на таких матеріалах: Альф, Буг, Грамена, Деснянський, Поленез, Львівський 1. Результати досліджень вказують, що використання живильного середовища за прописом Гамборга і Евелега є недоцільним для індукції калюсогенезу у вівсі, тому нами було вибрано інший склад середовища - Мурасіге і Скуга та модифіковано його. Слід відзначити, що важливим є використання in vitro сегментів черешків та листових пластинок, а не колосків. Використовуючи такі експланти, не потрібно проводити стерилізацію матеріалу, що дозволяє не тільки видалити процес стерилізації та введення вихідного матеріалу в культуру in vitro, але і зменшити затратні матеріали. Експериментальні дані свідчать, що недоцільно культивувати матеріал у термостаті упродовж трьох тижнів, а для вівса достатньо два тижні, що також дає можливість скоротити і прискорити отримання калюсних глобул. Ефективним та доцільним виявилось додавання у живильне середовище гіберелової кислоти - 0,5 мг/л та НОК - 0,5 мг/л. Дослідження також вказують, що потрібно зменшити майже вдвічі концентрації кінетину - до 0,5 мг/л, ІОК - 0,5 мг/л та 2,4 - Д - 0,5 мг/л, та збільшити на 10,0 г/л цукрози. Спосіб індукції калюсогенезу у вівсі здійснюється таким чином: як експланти для отримання калюсних глобул використовували in vitro сегменти черешків та листових пластинках вівса. На рослинному матеріалі робили насічки та висаджували їх на модифіковане живильне середовище за прописом Мурасіге і Скуга з додаванням БАП - 0,8 мг/л, 2,4 - Д - 0,5 мг/л, кінетину - 0,5 мг/л, ІОК - 0,5 мг/л, НОК - 0,5 мг/л, гіберелової кислоти - 0,5 мг/л, цукрози - 30,0 г/л. В подальшому проводили культивування матеріалу у темряві в термостаті упродовж 2 тижнів, а потім на світлі при температурі 24±2 °С і 16 годинному фотоперіоді. Маса калюсних глобул становила - 2,1 г (табл.). Таблиця Спільні та відмінні показники ефективності використання запропонованого способу індукції калюсогенезу у вівсі Показники Стерилізація Експозиція, хвилин Відомий спосіб 70 % розчин етанолу 45 Експлант Мінеральна основа середовища БАП мг/л Кінетин, мг/л ІОК мг/л НОК мг/л Цукроза, г/л 2,4-Д, мг/л Гіберелова кислота, мг/л Довжина фотоперіоду, годин Температура культивування, °C Умови культивування Термін культивування, тижні Маса калюсу, г 30 колоски Гамборга і Евелега 0,5-0,8 0,8-1,0 1,5-2,0 20,0 0,8-1,0 16 24±2 темрява 3 1,6-1,8 Запропонований спосіб сегменти черешків, листові пластинки Мурасіге і Скуга 0,8 0,5 0,5 0,5 30,0 0,5 0,5 16 24±2 темрява 2 2,1 Впровадження запропонованої корисної моделі дозволить отримати калюс у вівсі за використання in vitro експлантів - сегментів черешків та листових пластинок, підібрати і модифікувати склад живильного середовища, скоротити строки культивування, пришвидшити отримання калюсних глобул. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб індукції калюсогенезу у вівсі, що включає використання in vitro сегментів черешків та листових пластинок, приготування агаризованого живильного середовища, культивування проводять у темряві, а потім на світлі за температури 24±2 °C та 16 годинному фотоперіоді, 2 UA 89430 U який відрізняється тим, що культивують в темряві 2 тижні, використовують середовище Мурасіге і Скуга з додаванням: БАП - 0,8 мг/л, 2,4 - Д - 0,5 мг/л, кінетину - 0,5 мг/л, ІОК - 0,5 мг/л, НОК - 0,5 мг/л, гіберелової кислоти - 0,5 мг/л, цукрози - 30,0 г/л. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3