Спосіб індукції і спонтанної поліплоїдизації ембріокультури буряків

Реферат: UA 82454 U UA 82454 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі сільського господарства і може бути використана в селекції і генетиці рослин, зокрема для створення нового дигаплоїдного і тетраплоїдного стабілізованого за плоїдністю вихідного матеріалу цукрових буряків. Відомий спосіб одержання ембріокультури, а саме гаплоїдних і дигаплоїдних рослин цукрових буряків з використанням культури ізольованих насіннєбруньок і зародків в культурі in vitro [Білоус В.О., Ільєнко І.І., Олійник Н.А. та ін. До методики одержання гаплоїдних рослин цукрових буряків з ізольованих незапліднених насіннєвих зачатків. // Цукрові буряки. - 2006. № 6. - С. 12-13.] Основною суттєвою ознакою відомого способу є те, що ізольовані насіннєбруньки висаджують на поживне середовище в культурі in vitro для одержання макроструктур і регенераційноздатних калюсних культур. Серед макроструктур надалі формуються калюси і проростки прямої регенерації, із яких відбирають гаплоїди і диплоїди, а також формуються морфогенні і неморфогенні калюсні культури. Диплоїди в більшості випадків при прямій регенерації формуються із клітин материнської рослини і не є гомозиготними. Морфогенний калюс формує лінії-клони різного ступеня плоїдності і є джерелом генетичної мінливості завдяки непрямому поділу клітин, інверсіям і транслокаціям. Проте на практиці може бути введений в селекційний процес лише диплоїдний і тетраплоїдний вихідний матеріал із збалансованою кількістю хромосом. Добір гаплоїдів і поліплоїдизація за відомим способом проводиться з використанням цитологічних методів з прямим підрахунком кількості хромосом. Спільні суттєві ознаки відомого способу і пропонованої нами корисної моделі: - виділення ізольованих насіннєбруньок і зародків; - культивування їх на поживних середовищах; - відбір регенераційноздатних калюсних культур і гаплоїдів. Проте у відомому способі для створення дигаплоїдних ліній із виділених гаплоїдних мікророслин запропоновано використовувати середовище з 0,1 % колхіцином, а визначення плоїдності регенерантів можливе лише за допомогою складного цитологічного аналізу, де при цьому аналізується апікальна меристема одного із клонів і ми стабілізуємо надалі регенеранти із сусідніх клонів випадкової і дуже часто іншої плоїдності. Такий процес стабілізації калюсних культур є досить трудомістким, потребує великої кількості пересадок і на відміну від корисної моделі, що заявляється, значних затрат часу та праці. Відомий спосіб індукції ембріокультури із недозрілих насіннєбруньок в умовах in vitro. [Подвигіна О.А. Индуцирование гаплоидии из неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы в условиях in vitro. / Энциклопедия рода Beta L. // Новосибирск: - 2010. - С. 455-465.]. Спільними суттєвими ознаками відомого способу і пропонованої корисної моделі є визнання для регулювання процесу утворення ембріокультури екзогенних факторів таких як: - генотип і плазмотип донорних рослин; - стадії розвитку жіночого гаметофіту; - розміщення експланта на рослині; - культивування експлантів при 16-годинному фотоперіоді і освітленні 5 тис. люк. Частота формування гаплоїдів при цьому змінюється від 0,6 до 11,1 %, що є доказом генетичного контролю морфогенного розвитку насіннєбруньок. Індукція чотирьох напрямків морфогенезу незапліднених насіннєбруньок є також спільною ознакою відомого способу і корисної моделі. Відмінною суттєвою ознакою пропонованого способу є інший склад поживних середовищ і насамперед співвідношення цитокінінів і ауксинів 4:1, при якому досягається високий рівень регенерації морфогенного калюсу від 1,4 % до 39,5 % у порівнянні із відомим способом від 1,1 % до 14 % вторинних регенерантів від кількості висаджених насіннєбруньок, що забезпечує висока концентрація гібереліну 2 мг/л. Проте для регенерантів за відомого способу характерний некроз мікроклонів, який досягає близько 45,5 %, а життєздатність рослин на середовищі з гібереліном змінюється від 45,5 % до 100 % залежно від генотипу. Для виживання необхідно було передування поживних середовищ за ростовою - безгормональною - ростовою функцією. У відомому способі з використанням цитологічного аналізу частка гаплоїдних клітин залишається не контрольованою, а цикл поділу гаплоїдних клітин в 1,4 рази коротше диплоїдного, а тому такі міксоплоїди через деякий час відновлюють попередній рівень плоїдності рослин, проте лише цитофотометричні методи дозволяють відібрати серед регенерантів матеріали із максимальною присутністю фракцій диплоїдних клітин і прискорити 1 UA 82454 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 добір стабілізованого вихідного матеріалу, що є суттєвою перевагою пропонованої корисної моделі перед відомим способом. Відмінною суттєвою ознакою відомого способу Подвигіної О.А. є процес поліплоїдизації ембріокультури шляхом колхіцинування 0,03 % розчином колхіцину протягом 48 годин, відбір за допомогою методу цитологічного аналізу, культивування на поживному середовищі, що включає 0,25 мг/л кінетину. Чередування без гормонального - ростового - без гормонального поживних середовищ є відмінною рисою відомого способу індукції і стабілізація ембріокультури перед пропонованим способом. Найближчим аналогом є спосіб підвищення виходу гаплоїдів буряків цукрових і морфогенного калюсу та спонтанної поліплоїдизації Рябовол Л.О., Парій Ф.М. Патент на корисну модель № 24323 від 25.06 2007 р. Спосіб підвищення виходу гаплоїдних рослин цукрових буряків; Опубл. 25.06. 2007, Бюл. №9. Спільними суттєвими ознаками найбільш близького і пропонованого способу є: - склад мікро- і макро солей за Мурасіге-Скуга; - холодова перед обробка для отримання гаплоїдних структур і морфогенного калюсу в культурі in vitro; - присутність в складі живильного середовища 2,4 Д і БАП - спонтанна поліплоїдизація впродовж культивування мікророслин в умовах in vitro. Проте близький спосіб відрізняється від пропонованого способу: - концентрацією і співвідношенням гормонів БАП і 2;4 Д; - стимуляцією гаплоїдії і спонтанної поліплоїдизації пилком дикого виду Beta webbiana L.; - присутністю 0,5 мг/л ГК і 0,1 мг/л ІМК; - індукцією морфогенного калюсу при пересадці на інше середовище; - тривалістю процесу спонтанної поліплоїдизації і необхідністю добору донорських гетерозиготних за забарвленням гіпокотелю рослин. У дослідному варіанті 20,7 % насіннєбруньок регенерували калюсну тканину, 7,4 % гаплоїдні і 4,8 % диплоїдні проростки. Відмінною ознакою корисної моделі запропонованого способу є те, що сформовані первинні калюсні культури не переносили на інші регенераційні живильні середовища для формування морфогенного калюсу, що зменшує трудозатратність відомого способу і втрату первинного калюсу при пересадці. Визнання того, що культивування стимулюють процеси спонтанної поліплоїдизації є спільною суттєвою ознакою найбільш близького способу [Рябовол Л.О. Київ. Автореферат д.с-г.н]. "Розробка біотехнологічних методів і використання їх для створення вихідного селекційного матеріалу буряків цукрових (Beta Vulgaris L.). К., 2009. - С. 23. Проте у найбільш близькому способі для спонтанної диплоїдизації 72-80 % матеріалів був необхідний досить тривалий термін до 16 місяців. Оновлення проводяться через 2 місяці. Спільною суттєвою ознакою пропонованого способу і близького способу є використання явища спонтанної поліплоїдизації та формування клітин зі збалансованим набором хромосом, тобто 2х, 3х і 4х, які можуть слугувати джерелом вихідного рослинного матеріалу визначеної плоїдності для селекційного процесу. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб індукції і спонтанної поліплоїдизації ембріокультури буряків шляхом використання штучних живильних середовищ з певним співвідношенням цитокінінів і ауксинів (4:1) та включенням цитофотометричних методів з комп'ютерним аналізом АП "Partec", що скорочують термін і ефективність стабілізуючого доборів за плоїдністю, зменшуючи втрати часу та уникаючи часткової дегенерації первинного калюсу при пересадці на інше середовище для морфогенезу. Суть пропонованої корисної моделі полягає в тому, що на відміну від відомих способів виділення регенераційноздатних калюсних культур проходить на одному й тому ж середовищі, як для первинного калюсу, так і для індукції морфогенного калюсу. Термін індукції протягом 40 днів, пересадка через 10 днів. Суттєвою ознакою корисної моделі є те, що процес спонтанної поліплоїдизації проходить протягом 4-х пасажів, що значно менше ніж тривалий термін (16 місяців) близького способу. Введений новий метод проточної цитометрії з використанням АП "Partec" і створення дигаплоїдних ліній і вихідних матеріалів із калюсної тканини забезпечує високу ефективність добору за кількісним вмістом ядерної ДНК, що дозволяє розхимерювати матеріал, відбирати для пересадки клони з необхідною за плоїдністю фракцією клітин, що суттєво скорочує термін стабілізуючого добору вихідних матеріалів для селекційних досліджень. Даний спосіб є ефективним прийомом добору дигаплоїдних ліній і нових стабілізованих за плоїдністю вихідних матеріалів із калюсної тканини. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, який включає: культивування на поживних середовищах ізольованих насіннєбруньок донорських рослин буряків, одержання 2 UA 82454 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 макроструктур, регенерація мікророслин і оцінка плоїдності для добору гаплоїдних та дигаплоїдних ліній-клонів, згідно з корисною моделлю, в складі живильних середовищ запропоновано використовувати поряд з білками за Мурасіге-Скуга певне співвідношення цитокінінів і гетероауксинів (4:1), досягаючи морфогенного калюсу у відсотковому співвідношенні до первинного більше 90 % із спонтанною поліплоїдизацією регенерантів в результаті стабілізуючого добору за плоїдністю впродовж чотирьох пасажів з використанням для ідентифікації гаплоїдів і дигаплоїдів цитофотометричних методів. Дослідження співвідношення цитокінінів і гетероауксинів поряд з визначеною концентрацією амінокислот, гіберелової кислоти, макро- і мікросолей дозволяє збільшити вихід морфогенного калюсу у порівнянні із близьким способом до 39,5 % від всіх посаджених насіннєбруньок. Використання лише одного живильного середовища для морфогенного калюсу зменшує трудозатратність в процесі пересадки і збільшує вихід регенерантів, як нового вихідного матеріалу. Використання спонтанної поліплоїдизації в процесі декількох термінів пасажів значно скорочує тривалий процес стабілізації відомих способів після індукції колхіцином у порівнянні із добором за кількістю хромосом. Використання нового способу флуоресцентної цитофотометрії для стабілізації ембріокультури дозволяє скоротити затрати часу і вилучити екологічно небезпечні хімічні речовини, що використовуються для хромосомного аналізу. Таким чином нові ознаки корисної моделі, якими характеризується спосіб індукції і спонтанної стабілізації ембріокультури буряків в умовах in vitro є: - відмінний склад живильного середовища; - спонтанна поліплоїдизація гаплоїдних і дигаплоїдних регенерантів для одержання гомозиготних ліній, отриманих методом індукції калюсної тканини і методом прямої регенерації; - новий метод стабілізації плоїдності калюсних і дигаплоїдних ліній за кількісним вмістом ядерної ДНК; - використання лише одного живильного середовища для формування первинних калюсних культур і морфогенного калюсу; - вихід морфогенного калюсу у відсотковому співвідношенні до первинного більше 90 %. Запропонований спосіб отримання дигаплоїдних ліній і нових диплоїдних, тетраплоїдних вихідних матеріалів із калюсної культури виконують таким чином: вводять в стерильну культуру насіннєбруньки на початку і всередині цвітіння висадків. Матеріал поміщали в поліетиленовий пакет зі зволоженим фільтрувальним папером і зберігали у холодильнику до 4 діб при температурі +4 °C. Стерилізують бутони 5-10 %-розчином хлораміну протягом 30 хвилин, потім 3-4 рази промивали стерильною дистильованою водою. Висаджені насіннєві зачатки 2-3 тижні культивували у темряві при температурі +27-33 °C, а потім при денному світлі. Виділені в результаті експерименту генотипи і плазмотипи з високим ембріогенним потенціалом можуть надалі бути використані в дослідженнях з генетичної інженерії і генетичної трансформації геному і плазмону цукрових буряків. Одержані із калюсів методом прямої регенерації клони депонують в умовах in vitro, а плоїдність визначають на листках регенерантів в процесі пересадки на поживне середовище в умовах стерильних ламінарів. 2 Для приготування суспензії ядер використовують листки мікроклонів (1-2 см ), які подрібнюють гострим лезом (уникаючи роздавлювання) в чашках Петрі з додаванням 0,5 мл буфера [Роїк М.В., Ковальчук Н.С., Алексійчук Л.В., 2006.]. 3 Вимір інтенсивності флуоресценції та числа ядер в 1 см розчину виконують на цитометрі "Partec" за результатом диференціації клітин різної плоїдності за гістограмами ядерної ДНК. 3 UA 82454 U Таблиця 1 Інтенсивність морфоутворення на різних етапах ембріогенезу цукрових буряків залежно від генотипу і плазмотипу вихідного матеріалу № Склад середовища Макроелементи по Гамборгу Мікроелементи по Гамборгу 5 10 1 мл Вітаміни по 3 50 мл 1 мл Мезоінозит Сахароза НОК; 6 БАП; Гіберелова к-та; 2,4 Д Агар 100 мг 20 мг 0,1 мл 0,4 мл 0,2 мл 0,1 мл 9г Експериментальний номер F1 №10 F3S Етап морфогенезу F1 S (Греція) (Туреччина) (Туреччина) шт. % шт. % шт. % Калюс 4 0,23 3 3,5 0,7 4 0,94 7 8,1 52 Всього 1 2 Прямий соматичний ембріогенез Морфогенний калюс 1,4 18,2 6 1,4 34 39,5 285 426 86 Згідно з даними таблиці 1, із посаджених насіннєбруньок за селекційним номером F1S (Греція) було отримано 56 регенерацій первинного калюсу, із них надалі сформувались 4 калюсні структури, 52 регенераційноздатні калюсні структури і 2 прямі регенерації. Вихід морфогенного калюсу у відсотковому співвідношенні до первинного більше 90 % залежав від генотипу і плазмотипу донорних рослин. Отримані рослини-регенеранти із калюсних культур розділили на окремі лінії, які досліджували за динамікою геномної мінливості і відбирались з високим відсотком фракції диплоїдних клітин. При пасажуванні рослини-регенеранти змінювали плоїдність, та до 4-го пасажу всі клони стабілізувались і мали чіткий диплоїдний стан. На першому пасажі були тільки гаплоїдні і міксоплоїдні рослини. Частина гаплоїдів вже з 2-го пасажу характеризувалась стабільним диплоїдним рівнем. Друга частина гаплоїдних рослин протягом 4-ох пасажів змінювала плоїдність: міксоплоїдну, диплоїдну із фракцією клітин на каналі 70, 150 Табл. 2. 15 Таблиця 2 Аналіз динаміки геномної мінливості калюсних культур, отриманих від гібридів F1S (Греція) в умовах in vitro з використанням АП "Partec" Динаміка геномної мінливості калюсних культур залежно від терміну пасажу* Експе- Показники римен- морфо1-ий 2-ий 3-ий 4-ий тальний утворення плоїдплоїдпік ДНК плоїдність пік ДНК плоїдність пік ДНК пік ДНК номер ** шт. ність ність 1 54 50, 100, 200 n, 2n, 4n 100 2n 100 2n 100 2n 2 44 70, 150 1,5n, 3n 100 2n 70 1,5n 100 2n 3 8 70, 150 1,5n, 3n 100 2n 4 13 70, 150, 300 1,5n, 3n, 6n 100 2n 70, 150 1, 5n, 3n 100 2n 5 74 50 n 50 n 100 2n 100 2n 6 61 50 n 100 2n 100 2n 100 2n 7 46 50 n 70 1,5n 100 2n 100 2n 8 9 50 n 50, 100, 200 n, 2n, 4n 100 2n 100 2n 9 52 50 n 70 1,5n 70, 150 1, 5n, 3n 100 2n 10 23 50 n 70 1,5n 70 1,5n 100 2n 11 63 50 n 100 2n 100 2n 100 2n 12 140 50 n 70 1,5n 100 2n 100 2n 4 UA 82454 U Примітка: пасаж* - термін клоноутворення при депонуванні нового покоління клональних ліній в умовах in vitro Показники морфоутворення** - інтенсивність формування регенерантів у вторинних калюсних культур 5 10 15 20 25 Таким чином пропонований спосіб одержання динаплоїдних ліній із ембріокультури буряків in vitro забезпечує утворення морфогенних калюсних культур, що перевищує відомі способи в 4 рази, зменшуючи трудозатратність і втрату при пересадці первинного калюсу на безгормональне, ростове середовище у відомому способі та збільшує ефективність добору за плоїдністю завдяки спонтанній стабілізації в процесі мікроклонального розмноження у 8 разів з використанням цитофотометричних методів. Є більш ефективним і безпечним в застосуванні, так як вилучає використання поліплоїдизуючої мутагенної речовини колхіцину та зменшує трудозатратність цитологічних досліджень. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб індукції і спонтанної поліплоїдизації ембріокультури буряків, що включає: культивування на поживних середовищах ізольованих насіннєбруньок донорських рослин буряків, одержання макроструктур, регенерацію мікророслин і оцінку плоїдності для добору гаплоїдних та дигаплоїдних ліній-клонів, який відрізняється тим, що в складі живильних середовищ запропоновано використовувати поряд з білками за Мурасіге-Скуга певне співвідношення цитокінінів і гетероауксинів (4:1), досягаючи морфогенного калюсу у відсотковому співвідношенні до первинного більше 90 % із спонтанною поліплоїдизацією регенерантів в результаті стабілізуючого добору за плоїдністю впродовж чотирьох пасажів з використанням для ідентифікації гаплоїдів і дигаплоїдів цитофотометричних методів. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5