Спосіб підвищення фізіологічної активності ентеробактерій escнeriснia coli aбo enterococcus faecalis

Спосіб підвищення фізіологічної активності ентеробактерій Escherichia coli або Enterococcus 3 інші, наприклад, Zn2+ Co2+ , знайдені у металоферментах і є надкислотними каталізаторами обмінних процесів [Дюга Г., Пенни К. Биоорганическая химия, М: Мир, 1983, с. 342-343 ]. У той же час деякі метали, такі як ртуть, кадмій і арсен - ефективні інгібітори ферментів. Ці метали, так як і інші важкі метали, у визначених дозах виявляють токсичну дію на живі організми, через що деякі з них широко використовують при створенні бактеріцидних препаратів. Дослідження, присвячені вивченню дії важких металів на мікроорганізми, показали, що ці метали в іонній формі у широкому інтервалі досліджуваних концентрацій виявляють інгібування фізіологічної активності клітин [Лебедев B.C. Особенности действия тяжелых металлов на мембрану Escherichia coli, Изв.АН СССР, сер.биол.,1986,№3, с.37-377; Федоров Ю.И., Володина Л.А. и др. О механизме антимикробной активности высокодисперсного порошка меди, Изв.АН СССР, сер.биол.,1984,№1,с.153; Кульский Л.А.Серебряная вода,К: Наук.думка.1971, с. 9-35]. Нами вперше встановлено, що при застосуванні металу, вибраного з групи: цинк, мідь, срібло, золото, платина, у вигляді нанорозмірних колоїдних частинок у тих концентраціях, що виходять за межі звичайних границь в область малих і надмалих доз, можна досягнути стимулювання клітинної мембрани і підвищення рівня інших показників фізіологічної активності ентеробактерій родів Escherichia і/або Enterococcus^ що виділені з кишечника умовно здорової людини. Це покладено в основу винаходу, завдання якого - розробка способу впливу на бактеріальну клітину ентеробактерій, який забезпечив би розширення арсеналу засобів, що використовують для підвищення фізіологічної активності бактерій, яка виявляється в інтенсифікуванні приросту біомаси, покращенні енергетичних, біохімічних та інших показників життєдіяльності і в остаточному підсумку - у підвищенні якості одержаної біомаси як компонента різноманітних біотехнологічних процесів і/або бактеріальних препаратів. Поставлена задача вирішена пропонованим способом підвищення фізіологічної активності ентеробактерій, що виділені з кишечника умовно здорової людини, введенням у середовище культивування біологічно активної речовини, в якому згідно з винаходом як біологічно активну речовину використовують метал, вибраний з групи: цинк, мідь, срібло, золото, платина, у вигляді колоїдних частинок в кількості, яка забезпечує вміст металу у поживному середовищі в межах 10-8 - 10-1мкг/мл. При цьому цинк рекомендується вводити у кількості 10-4 - 10-2мкг/мл, мідь - 10-7-10-5, срібло - 106 -10-3, золото - 10-6-10-3, платину - 10-7-10-5мкг/мл, тому що при такому вмісті у поживному середовищі кожний з вказаних металів виявляє найбільший стимулювальний ефект на бактерії. Відповідно до винаходу, попередньо приготований препарат нанорозмірних колоїдних частинок (розміром 0,1 - 100нм), які містять один з пропонованих металів, уводять в поживне середовище під час культивування ентеробактерій і здійснюють 90311 4 інкубування в присутності надмалої кількості метала. На наведених нижче прикладах здійснення винаходу переконливо показана можливість підвищення фізіологічної активності ентеробактерій штамів Escherichia coli Г35 № 1-413, Escherichia coli Г35 № 2-412, Escherichia coli Г35 № 3-411, Streptococcus faecalis Г35 № 4-410 під дією надмалих доз пропонованих металів, які введено у вигляді колоїдних частинок, що дозволяє розширити асортимент запропонованих для таких цілей засобів. Таким чином, поставлену задачу вирішено з досягненням необхідного технічного результату. Вказані метали можна вводити в поживне середовище під час культивування бактерій у вигляді водних колоїдних розчинів, які одержують методом послідовного розведення відповідних гідрозолів. Для одержання гідрозолів використовують відомі описані у літературі способи і зокрема методики отримання високодисперсних металевих гідрозолів (золота, срібла, платини) відновлюванням металу з його сполук у водному середовищі придатним відновлювачем, які передбачають застосування спеціальних заходів (температурний режим, застосування стабілізаторів та інш.) для утворення стійких гідрозолів. [Методические разработки к практикуму по коллоидной химии, ч. II, Изд-во МГУ им. М.В. Ломоносова, под ред. А.В. Перцова, М:, 1976, с. 126-130; В. Наумов. Руководство по коллоидной химии, М., 1917 г.] Для приготування препаратів колоїдних частинок, що містять важкі метали (мідь, цинк) можна використовувати також відомі методики одержання гідрогелів, в основі яких лежать обмінні реакції розчинних солей важкого металу з лугом з виділенням нерозчинного у воді гідроксиду металу та створення необхідних умов для міцелоутворення [А.В. Думанский. Учение о коллоидах, Госхимиздат, 1948, с. 292-298]. Технологія одержання і застосування таких форм пропонованих металів проста, матеріали і реактиви доступні, їх витрата, враховуючи низький рівень застосовуваних доз, відносно невелика при забезпеченні значного позитивного впливу на мікроорганізми. Все це свідчить за промислову придатність винаходу, а також про економічні переваги способу, що заявляється. Приклади. У наведених нижче прикладах здійснення винаходу (приклади 2-6) проводили культивування штамів ентеробактерій, що виділені з кишечника умовно здорової людини: Escherichia coli Г35 № 1413, Escherichia coli Г35 № 2-412, Escherichia coli № 3-411, Streptococcus faecalis Г35 № 4-410 (задепоновані у Депозитарії Державного науковоконтрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів, м. Київ), у присутності пропонованих металів у колоїдній формі і оцінювали інтенсивність росту культур, а також показники інтенсивності енергетичних процесів у бактеріальних клітинах - АТФазну активність і респіраторну активність. Ті ж самі показники фізіологічної активності визначали для ентеробактерій, які вирощували без застосування металів (приклад 1 порівняль 5 ний), і шляхом порівняння з результатами, що одержано при застосуванні пропонованого способу, оцінювали досягнутий ефект інтенсифікуфання фізіолого-біохімічних процесів ентеробактерій вказаних штамів. Приклад 1 порівняльний. Культивування чотирьох вищеназваних штамів ентеробактерій здійснювали в конічних колбах об'ємом 250мл, в які поміщали 125мл багатого поживного середовища - м'ясопептонного бульйону (МПБ). У кожну з колб вносили засівну дозу штаму бактерій, поміщали колби на орбітальну качалку і протягом 24 годин проводили процес культивування при інтенсивності перемішування 160об/хв. і температурі 37 2°С. Однакова величина засівної дози бактерій у всіх зразках (50мкг/мл) визначала однакову величину показника оптичної густини (D630) зразків клітинної суспензії у вихідному стані - 0,105 одиниць. Приклад 2. Культивування штамів ентеробактерій проводили як описано у прикладі 1, однак процес вели у присутності цинку, який вводили в поживне середовище перед посівом клітин у вигляді розбавленого колоїдного розчину. Попередньо готували препарат колоїдних частинок, що містять цинк, взаємодією 0,4N водного розчину сірчанокислого цинку з 1,0N розчином їдкого натру в присутності етилендиамінтетраоцтової кислоти. Отриманий гідрозоль, що містить 2,07мг/мл цинку, розбавляли водою методом послідовних розведень і додавали до поживного середовища для культивування бактерій у кількості, що забезпечувала вміст цинку в культуральній рідині 2,0 10-3мкг/мл. Приклад 3. Культивування штамів ентеробактерій проводили як у прикладі 2, однак у МПБ вводили мідь у вигляді розбавленого гідрозолю. . Попередньо готували препарат колоїдних частинок, що мали в собі мідь, взаємодією 0,4N водного розчину сульфату міді з 1,0N розчином їдкого натру у присутності етилендіамінтетраоцтової кислоти. Отриманий гідрозоль з вмістом міді 2,01мг/мл розбавляли водою шляхом послідовних розведень та вводили його у поживне середовище у кількості, яка забезпечувала вміст міді у культуральній рідині 8,4 10-6мкг/мл. Приклад 4. Процес вирощування ентеробактерій проводили як описано у прикладі 2, однак у поживне середовище вводили колоїдне срібло у вигляді розбавленого гідрозолю. Попередньо одержували високодисперсний гідрозоль срібла за реакцією відновлення срібла із азотнокислого срібла таніном у водному лужному середовищі. Підбиранням кількісного співвідношення вихідних реагентів забезпечували вміст срібла у гідрозолі, що утворюється, - 230мкг/мл. Методом послідовних розведень гідрозоль розбавляли водою в 10000 разів та вносили отриманий розчин у підготовлене для культивування ентеробактерій поживне середовище (МПБ) у кількості, що забезпечувала вміст срібла у ньому 2,3 105 мкг/мл. 90311 6 Приклад 5. Процес культивування бактерій проводили як описано у прикладі 2, однак у поживне середовище вводили колоїдне золото у вигляді розбавленого гідрозолю. Попередньо одержували високодисперсний гідрозоль золота (розмір частинок близько 20нм) шляхом відновлення золота формальдегідом із водного розчину золотохлористоводневої кислоти у водному лужному середовищі (за Зігмонді). Підбиранням співвідношення вихідних реагентів забезпечували вміст золота у гідрозолі 50мкг/мл. Отриманий гідрозоль золота розбавляли у 1000 разів та вносили такий розбавлений колоїдний розчин у м'ясо-пептонний бульйон, підготовлений для культивування ентеробактерій, у кількості, що забезпечувала вміст металу у поживному середовищі 5 10-5мкг/мл. Приклад 6. Процес культивування клітин бактерій проводили як описано у прикладі 2, однак у поживне середовище вводили колоїдні частинки платини у вигляді розбавленого гідрозолю. Попередньо одержували високодисперсний гідрозоль платини за реакцією відновлення платини із водного розчину платинохлористоводневої кислоти (Н2РtСl6) формальдегідом у лужному середовищі при нагріванні. Підбиранням співвідношень вихідних реагентів та інших умов процесу забезпечували вміст платини у гідрозолі 5,1мкг/мл. Методом послідовних розведень гідрозоль розбавляли водою та вносили у поживне середовище (МПБ) для культивування бактерій у кількості, що забезпечувала вміст платини у культуральній рідині 1 10-6мкг/мл. Після 24 годин культивування в отриманих за прикладами 1- 6 зразках клітинної суспензії визначали величину її оптичної густини (за допомогою спектрофотометру СФ-46 при довжині хвилі 630нм) - показник D630 та по змінюванню цього показнику порівняно з оптичною густиною суспензій у вихідному стані (у всіх прикладах D630 = 0,105) робили висновок про інтенсивність росту культур. Для визначення інших показників фізіологічної активності бактерій зразки клітинних суспензій, отриманих за прикладами 1-6, центрифугували, клітини відокремлювали від поживного середовища та промивали дистильованою водою. Для визначення респіраторної активності невелику кількість підготовлених таким чином клітин кожного зразку ресуспендували у середовищі вимірювання (5мМ Трис-НСІ буфер, рН 7,8) та отриману суспензію із вмістом 0,3-1,0мг клітин у 1мл рідини (у перерахунку на суху речовину) поміщали у вимірювальну комірку кисень-чутливого електроду (тип Кларка, МО 128, «Mettler Toledo», Швейцарія) об'ємом 10мл, яка споряджена магнітною мішалкою і термостатується (t = 25 2 С) за допомогою ультратермостату ТМА 657, та вимірювали максимальну швидкість зниження концентрації кисню у клітинній суспензії в результаті поглинання його біомасою клітин (в мг O2/л хв.), яку приводили до одиниці ваги сухих клітин (в мг). 7 90311 Для визначення АТФазної активності клітин попередньо виконували процедуру виділення плазматичних мембран з усіх отриманих зразків клітин за відомим методом [Грузина Т.Г., Балакина М.Н., Карамушка В.Й., Ульберг З.Р. Микробиология, 1997, Т.66, №1, с.14-16]. АТФазну активність клітин оцінювали за швидкістю процесу гідролізу аденозинтрифосфату (АТФ) АТФазою їх плазма 8 тичних мембран у середовищі, яке містить АТФ, за методом Фіске-Субарроу [Fiske С., Subbarow J. // J. Biol. Chem. - 1925. -66, №1, P. 375-400]. Цей показник виражали у наномолях неорганічного фосфору (Фн), що утворюється в ході гідролізу АТФ, на 1мг білку плазматичних мембран клітин за хвилину (нмоль Фн/мг хв.). Таблиця 1 Штами ентеробактерій Показники фізіологічної актиStreptococcus вності через 24 години інку- Escherichia coli Г35 Escherichia coli Г35 Escherichia coli Г35 faecalis Г35 №4 бації № 1-413 № 2-412 № 3-411 410 Приріст біомаси, D630 0,985 0,915 0,944 0,855 АТФ-азна активність, нмольФФ 1250 1240 1125 1085 н мг хв Респіраторнамг активність, мгО2 2,47 2,54 2,50 2,22 л хв мг Таблиця 2 приклади 2 3 4 5 6 Характеристика металу вміст, назва мкт/мл цинк 2,0 10-3 -6 мідь 8,4 10 срібло 2,3 10-5 золото 5,0 10-5 платина 1,0 10-6 Приріст біомаси через 24 години інкубації, D630 Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Streptococcus faecalis Г35 № 1-413 Г35 № 2-412 Г35 № 3-411 Г35 №4 -410 1,240 1,280 1,305 1,270 1,205 1,272 1,288 1,254 1,211 1,218 1,227 1,195 1,284 1,295 1,320 1,315 1,202 1,273 1,211 1,234 Таблиця 3 Приклад 2 3 4 5 6 Штами ентеробактерій Escherichia coli Г35 № 1 -413 Escherichia coli Г35 № 2 -412 Streptococcus faecalis Г35 №4 -410 Escherichia coli Г35 № 1 -413 Escherichia coli Г35 № 2 -412 Streptococcus faecalis Г35 №4 –410 Escherichia coli Г35 № 3 -411 Escherichia coli Г35 № 2 -412 Streptococcus faecalis Г35 №4 -410 Escherichia coli Г35 №3 -411 Escherichia coli Г35 № 2 -412 Streptococcus faecalis Г35 №4 -410 Escherichia coli Г35 № 1 -413 Escherichia coli Г35 № 2 -412 Streptococcus faecalis Г35 №4 -410 Одержані дані щодо показників фізіологічної активності досліджених штамів ентеробактерій через 24 години інкубації без застосування металів (приклад 1 порівняльний) наведено у табл. 1. В Показники фізіологічної активності бактерій через 24 години інкубації АТФ-азна активність, Респіраторна активність, нмольФФ мгО2 н мг хв л хв мг 1540 4,15 1515 4,22 1320 4,08 1420 3,88 1380 3,95 1385 4,01 1375 4,12 1394 4,25 1302 4,10 1458 4,44 1415 4,15 1395 4,21 1417 4,13 1399 4,17 1426 4,33 таблиці 2 та 3 наведено результати оцінки фізіологічної активності тих самих штамів бактерій, які вирощували відповідно до винаходу (за прикладами 2-6) під дією зазначених металів, при цьому в 9 90311 таблиці 2 наведено дані з приросту біомаси бактерій через 24 години інкубації в присутності уведених в оптимальній кількості металів, а в таблиці 3 дані щодо інших показників фізіологічної активності бактерій, які вирощували в тих самих умовах. Порівняння даних таблиць 2 та 3 із даними, наведеними в таблиці 1, засвідчує, що метали (цинк, мідь, срібло, золото, платина), які були уведені в середовище культивування у вигляді колої Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 10 дних частинок із забезпеченням оптимального вмісту у ньому металу, справляють достовірно стимулюючу дію на всі досліджені штами ентеробактерій як за показниками росту, так і за іншими фізіолого-біохімічними параметрами, тобто виявляють біологічну активність; використання їх за таким призначенням дозволило створити новий спосіб активування ентеробактерій. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601