Спосіб підвищення фізіологічної активності ентеробактерій escherichia і/або enterococcus

1. Спосіб підвищення фізіологічної активності ентеробактерій Escherichia і/або Enterococcus, що виділені з кишечника умовно здорової людини, введенням в середовище культивування біологічно активної речовини, який відрізняється тим, що як біологічно активну речовину використовують метал, вибраний з групи: цинк, мідь, срібло, золо 3 37132 4 Спільним недоліком активуючи х добавок, які середовищі кожний з вказаних металів виявляє одержують на основі рослинної сировини, є віднонайбільший стимулювальний ефект на бактерії. сно складна технологія їх попередньої підготовки і Попередньо приготований препарат нанорозмалий строк зберігання. мірних колоїдних частинок (розміром 0,1-100нм), Відома активна роль металів у метаболізмі які містять один з пропонованих металів, уводять в живих організмів. Іони багатьох металів необхідні поживне середовище під час культивування ентеклітинам живих організмів. Одні з них (Na+, K+, робактерій і здійснюють інкубування в присутності Са2+) відносяться до життєво необхідних елеменнадмалої кількості метала. тів, що беруть участь у транспортних процесах, На наведених нижче прикладах переконливо інші, наприклад, Zn2+ Co2+, знайдені у металоферпоказана можливість підвищення фізіологічної ментах і є надкислотними каталізаторами обмінактивності ентеробактерій штамів Escherichia coli них процесів [Дюга Г., Пенни К. Биоорганическая Г35 № 1-413, Escherichia coli Г35 № 2-412, Esхимия, М: Мир, 1983, с. 342-343]. У той же час деcherichia coli Г35 № 3-411, Streptococcus faecalis які метали, такі як ртуть, кадмій і арсен - ефективні Г35 № 4-410 під дією надмалих доз пропонованих інгібітори ферментів. Ці метали, так як і інші важкі металів, які введено у вигляді колоїдних частинок, метали, у визначених дозах виявляють токсичну що дозволяє розширити асортимент запропоновадію на живі організми, через що деякі з них широко них для таких цілей засобів. використовують при створенні бактеріцидних преТаким чином, поставлену задачу вирішено з паратів. досягненням необхідного технічного результату. Дослідження, присвячені вивченню дії важких Вказані метали можна вводити в поживне семеталів на мікроорганізми, показали, що ці метали редовище під час культивування бактерій у вигляв іонній формі у широкому інтервалі досліджуваді водних колоїдних розчинів, які одержують метоних концентрацій виявляють інгібування фізіологідом послідовного розведення відповідних чної активності клітин [Лебедев B.C. Особенности гідрозолів. Для одержання гідрозолів використодействия тяжелых металлов на мембрану вують відомі описані у літературі способи і зокреEscherichia coli, Изв.АН СССР, сер.биол.,1986,№3, ма методики отримання високодисперсних метас.37-377; Федоров Ю.И., Володина Л.А. и др. О левих гідрозолів (золота, срібла, платини) механизме антимикробной активности высокодисвідновлюванням металу з його сполук у водному персного порошка меди, Изв.АН СССР, середовищі придатним відновлювачем, які передсер.биол.,1984,№1,с.153; Кульский бачають застосування спеціальних заходів (темЛ.А.Серебряная вода,К: Наук.думка,1971, с. 9-35]. пературний режим, застосування стабілізаторів та Нами вперше встановлено, що при застосуінш.) для утворення стійких гідрозолі в. [Методичеванні металу, вибраного з групи: цинк, мідь, срібские разработки к практикуму по коллоидной хило, золото, платина, у вигляді нанорозмірних коломии, ч. II, Изд-во МГУ им. М.В. Ломоносова, под їдних частинок у тих концентраціях, що виходять ред. А.В. Перцова, М:, 1976, с. 126-130; В. Наумов. за межі звичайних границь в область малих і надРуководство по коллоидной химии, М., 1917 г.] Для малих доз, можна досягнути стимулювання клітинприготування препаратів колоїдних частинок, що ної мембрани і підвищення рівня інших показників містять важкі метали (мідь, цинк) можна викорисфізіологічної активності ентеробактерій родів товувати також відомі методики одержання гідроEscherichia і/або Enterococcus, що виділені з кишегелів, в основі яких лежать обмінні реакції розчинчника умовно здорової людини. Це покладено в них солей важкого металу з лугом з виділенням основу корисної моделі, завдання якого - розробка нерозчинного у воді гідроксиду металу та створенспособу впливу на бактеріальну клітину ентеробаня необхідних умов для міцелоутворення [А.В. ктерій, який забезпечив би розширення арсеналу Думанский. Учение о коллоидах, Госхимиздат, засобів, що використовують для підвищення фізі1948, с. 292-298]. ологічної активності бактерій, яка виявляється в Технологія одержання і застосування таких інтенсифікуванні приросту біомаси, покращенні форм пропонованих металів проста, матеріали і енергетичних, біохімічних та інши х показників житреактиви доступні, їх витрата, вра ховуючи низький тєдіяльності і в остаточному підсумку - у підвирівень застосовуваних доз, відносно невелика при щенні якості одержаної біомаси як компонента забезпеченні значного позитивного впливу на мікрізноманітних біотехнологічних процесів і/або бакроорганізми. Все це свідчить за промислову притеріальних препаратів. датність корисної моделі, а також про економічні Поставлена задача вирішена пропонованим переваги способу, що заявляється. способом підвищення фізіологічної активності енПриклади теробактерій, що виділені з кишечника умовно У наведених нижче прикладах (приклади 2-6) здорової людини, введенням у середовище кульпроводили культивування штамів ентеробактерій, тивування біологічно активної речовини, в якому що виділені з кишечника умовно здорової люд и як біологічно активну речовину використовують ни: Escherichia coli Г35 № 1-413, Escherichia coli метал, вибраний з групи: цинк, мідь, срібло, золоГ35 № 2-412, Escherichia coli № 3-411, Streptococто, платина, у вигляді колоїдних частинок в кількоcus faecalis Г35 № 4-410 (задепоновані у Депозисті, яка забезпечує вміст металу у поживному сетарії Державного науково-контрольного інституту редовищі в межах 10-8 - 10 -1мкг/мл. біотехнології і штамів мікроорганізмів, м. Київ), у При цьому цинк рекомендується вводити у кіприсутності пропонованих металів у колоїдній фолькості 10-4 – 10-2мкг/мл, мідь –10-7- 10-5, срібло – рмі і оцінювали інтенсивність росту культур, а та10-6-10-3, золото – 10-6-10-3, платину – 10-7-10кож показники інтенсивності енергетичних проце5 мкг/мл, тому що при такому вмісті у поживному 5 37132 6 сів у бактеріальних клітинах - АТФазну активність і розчин у підготовлене для культивування ентерореспіраторну активність. бактерій поживне середовище (МПБ) у кількості, Ті ж самі показники фізіологічної активності що забезпечувала вміст срібла у ньому 2,3´105 визначали для ентеробактерій, які вирощували мкг/мл. без застосування металів (приклад 1 порівняльПриклад 5. ний), і шляхом порівняння з результатами, що Процес культивування бактерій проводили як одержано при застосуванні пропонованого спосоописано у прикладі 2, однак у поживне середовибу, оцінювали досягнутий ефект інтенсифікуфання ще вводили колоїдне золото у вигляді розбавлефізіолого-біохімічних процесів ентеробактерій вканого гідрозолю. заних штамів. Попередньо одержували високодисперсний гіПриклад 1 порівняльний. дрозоль золота (розмір частинок близько 20нм) Культивування чотирьох вищеназваних штамів шляхом відновлення золота формальдегідом із ентеробактерій здійснювали в конічних колбах водного розчину золотохлористоводневої кислоти об'ємом 250мл, в які поміщали 125мл багатого у водному лужному середовищі (за Зігмонді). поживного середовища - м'ясопептонного бульйоПідбиранням співвідношення вихідних реагенну (МПБ). У кожну з колб вносили засівну дозу тів забезпечували вміст золота у гідрозолі штаму бактерій, поміщали колби на орбітальну 50мкг/мл. Отриманий гідрозоль золота розбавляли качалку і протягом 24 годин проводили процес у 1000 разів та вносили такий розбавлений колоїкультивування при інтенсивності перемішування дний розчин у м'ясо-пептонний бульйон, підготов160об/хв. і температурі 37±2°С. лений для культивування ентеробактерій, у кількоОднакова величина засівної дози бактерій у сті, що забезпечувала вміст металу у поживному всіх зразках (50мкг/мл) визначала однакову велисередовищі 5´10-5мкг/мл. чину показника оптичної густини (D630) зразків кліПриклад 6. тинної суспензії у ви хідному стані - 0,105 одиниць. Процес культивування клітин бактерій провоПриклад 2. дили як описано у прикладі 2, однак у поживне Культивування штамів ентеробактерій провосередовище вводили колоїдні частинки платини у дили як описано у прикладі 1, однак процес вели у вигляді розбавленого гідрозолю. присутності цинку, який вводили в поживне сереПопередньо одержували високодисперсний гідовище перед посівом клітин у вигляді розбавледрозоль платини за реакцією відновлення платини ного колоїдного розчину. із водного розчину платинохлористоводневої кисПопередньо готували препарат колоїдних часлоти (H2PtCl6) формальдегідом у лужному середотинок, що містять цинк, взаємодією 0,4N водного вищі при нагріванні. розчину сірчанокислого цинку з 1,0N розчином Підбиранням співвідношень вихідних реагентів їдкого натру в присутності етилендиамінтетраоцта інших умов процесу забезпечували вміст платової кислоти. Отриманий гідрозоль, що містить тини у гідрозолі 5,1мкг/мл. 2,07мг/мл цинку, розбавляли водою методом поМетодом послідовних розведень гідрозоль слідовних розведень і додавали до поживного серозбавляли водою та вносили у поживне середоредовища для культивування бактерій у кількості, вище (МПБ) для культивування бактерій у кількосщо забезпечувала вміст цинку в культуральній ті, що забезпечувала вміст платини у культуральрідині 2,0´10-3мкг/мл. ній рідині 1´10-6мкг/мл. Приклад 3. Після 24 годин культивування в отриманих за Культивування штамів ентеробактерій провоприкладами 1-6 зразках клітинної суспензії визнадили як у прикладі 2, однак у МПБ вводили мідь у чали величину її оптичної густини (за допомогою вигляді розбавленого гідрозолю. спектрофотометру СФ-46 при довжині хвилі Попередньо готували препарат колоїдних час630нм) - показник D360 та по змінюванню цього тинок, що мали в собі мідь, взаємодією 0,4N водпоказнику порівняно з оптичною густиною суспенного розчину сульфату міді з 1,0N розчином їдкого зій у вихідному стані (у всіх прикладах натру у присутності етилендіамінтетраоцтової кисD630=0,0105) робили висновок про інтенсивність лоти. Отриманий гідрозоль з вмістом міді росту культур. 2,01мг/мл розбавляли водою шляхом послідовних Для визначення інших показників фізіологічної розведень та вводили його у поживне середовище активності бактерій зразки клітинних суспензій, у кількості, яка забезпечувала вміст міді у культуотриманих за прикладами 1-6, центрифугували, ральній рідині 8,4´10-6м кг/мл. клітини відокремлювали від поживного середовиПриклад 4. ща та промивали дистильованою водою. Процес вирощування ентеробактерій провоДля визначення респіраторної активності недили як описано у прикладі 2, однак у поживне велику кількість підготовлених таким чином клітин середовище вводили колоїдне срібло у вигляді кожного зразку ресуспендували у середовищі вирозбавленого гідрозолю. мірювання (5мМ Трис-НСІ буфер, рН 7,8) та отриПопередньо одержували високодисперсний гіману суспензію із вмістом 0,3-1,0мг клітин у 1мл дрозоль срібла за реакцією відновлення срібла із рідини (у перерахунку на суху речовину) поміщали азотнокислого срібла таніном у водному лужному у вимірювальну комірку кисень-чутливого електросередовищі. Підбиранням кількісного співвідноду (тип Кларка, МО 128, «Mettler Toledo», Швейцашення вихідних реагентів забезпечували вміст рія) об'ємом 10мл, яка споряджена магнітною місрібла у гідрозолі, що утворюється, - 230мкг/мл. шалкою і термостатується (t=25±2°С) за Методом послідовних розведень гідрозоль розбадопомогою ультратермостату ТМА 657, та вимірювляли водою в 10000 разів та вносили отриманий вали максимальну швидкість зниження концентра 7 37132 8 ції кисню у клітинній суспензії в результаті поглигічної активності тих самих штамів бактерій, які вирощували запропонованим способом (за принання його біомасою клітин (вмг О2/л×хв.), яку приводили до одиниці ваги сухи х клітин (в мг). кладами 2-6) під дією зазначених металів, при цьому в таблиці 2 наведено дані з приросту біомаДля визначення АТФазної активності клітин си бактерій через 24 години інкубації в присутності попередньо виконували процедуру виділення плауведених в оптимальній кількості металів, а в табзматичних мембран з усіх отриманих зразків клітин лиці 3 - дані щодо інших показників фізіологічної за відомим методом [Грузина Т.Г., Балакина М.Н., Карамушка В.Й., Ульберг З.Р. Микробиология, активності бактерій, які вирощували в тих самих умовах. 1997, Т.66, №1, с. 14-16]. АТФазну активність кліПорівняння даних таблиць 2 та 3 із даними, тин оцінювали за швидкістю процесу гідролізу наведеними в таблиці 1, засвідчує, що метали аденозинтрифосфату (АТФ) АТФазою їх плазма(цинк, мідь, срібло, золото, платина), які були уветичних мембран у середовищі, яке містить АТФ, за методом Фіске-Субарроу [Fiske С., Subbarow J. // J. дені в середовище культивування у вигляді колоїдних частинок із забезпеченням оптимального Biol. Chem. - 1925. -66, №1, P. 375-400]. Цей покавмісту у ньому металу, справляють достовірно зник виражали у наномолях неорганічного фосфостимулюючу дію на всі досліджені штами ентерору (Фн), що утворюється в ході гідролізу АТФ, на бактерій як за показниками росту, так і за іншими 1мг білку плазматичних мембран клітин за хвилину фізіолого-біохімічними параметрами, тобто вияв(нмоль Фн/мг×хв.). ляють біологічну активність; використання Їх за Одержані дані щодо показників фізіологічної таким призначенням дозволило створити новий активності досліджених штамів ентеробактерій спосіб активування ентеробактерій. через 24 години інкубації без застосування металів (приклад 1 порівняльний) наведеноу табл. 1. В таблиці 2 та 3 наведено результати оцінки фізіолоТаблиця 1 Показники фізіологічної активності через 24 години Escherichia coli Г35 інкубації № 1-413 Приріст біомаси, D630 0,985 АТФ-азна активність, 1250 нмольФн мг × хв. Респіраторна активність, 2,47 мгО2 л × хв × мг Штами ентеробактерій Escherichia coli Escherichia coli Г35 № 2-412 Г35 Xs 3-411 0,915 0,944 Streptococcus faecalis Г35 №4 -410 0,855 1240 1125 1085 2,54 2,50 2,22 Таблиця 2 приклади 2 3 4 5 6 Характеристика металу Приріст біомаси через 24 години інкубації, D630 вміст, Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Streptococcus faecalis назва мкг/мл Г35 № 1-413 Г35 № 2-412 Г35 № 3-411 Г35 №4 -410 цинк 2,0-10-3 1,240 1,280 1,305 1,270 мідь 8,4-10-6 1,205 1,272 1,288 1,254 срібло 2,3-10-5 1,211 1,218 1,227 1,195 золото 5,0-10-5 1,284 1,295 1,320 1,315 платина 1,0-10-6 1,202 1,273 1,211 1,234 Таблиця 3 Приклад 2 3 Штами ентеробактерій Escherichia coli Г35№ 1-413 Escherichia coli Г35 № 2-412 Streptococcus faecalis Г35 №4-410 Escherichia coli Г35 № 1-413 Escherichia coli Г35 № 2-412 Streptococcus faecalis Г35 №4-410 Показники фізіологічної активності бактерій через 24 години інкубації АТФ-азна активність, Респіраторна активність, нмольФн мгО2 мг × хв. . л × хв × мг 1540 4,15 1515 4,22 1320 4,08 1420 3,88 1380 3,95 1385 4,01 9 37132 10 Продовження таблиці 3 Приклад 4 5 6 Штами ентеробактерій Escherichia coli Г35 Xo 3-411 Escherichia coli Г35 № 2-412 Streptococcus faecalis Г35 №4-410 Escherichia coli Г35 №3-411 Escherichia coli Г35 № 2-412 Streptococcus faecalis Г35 Xfi4-410 Escherichia coli Г35 № 1-413 Escherichia coli Г35 № 2-412 Streptococcus faecalis Г35 №4-410 Комп’ютерна в ерстка А. Крижанівський Показники фізіологічної активності бактерій через 24 години інкубації АТФ-азна активність, Респіраторна активність, нмольФн мгО2 мг × хв. . л × хв × мг 1375 4,12 1394 4,25 1302 4,10 1458 4,44 1415 4,15 1395 4,21 1417 4,13 1399 4,17 1426 4,33 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601