Спосіб визначення генотоксичної дії хімічного або фізичного чинника

Реферат: UA 90336 U UA 90336 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі генетичної безпеки і може бути використана у сучасних методах визначення генотоксичної дії хімічного або фізичного фактора. Відомий спосіб визначення генотоксичної (мутагенної) дії зовнішнього чинника, що передбачає облік рецесивних, зчеплених зі статтю летальних мутацій (РЗСЛМ) у дрозофіли [1, С. 260-261], у якому самців лінії дикого типу, що зазнали впливу досліджуваного фактора, схрещують з самками тесторної лінії Мьоллєр-5 і через покоління визначають рівень РЗСЛМ за часткою культур, у яких відсутні самці дикого типу, від загальної кількості проаналізованих культур. Недоліком означеного способу є його значна тривалість, трудомісткість і необхідність проведення великої кількості схрещувань. Відомий спосіб визначення мутагенної дії зовнішнього чинника [1, С. 270-271], що вибраний за сукупністю ознак найближчим аналогом до запропонованої моделі, передбачає дослідження частоти виникнення мутацій у Drosophila melanogaster Meig. Недоліками зазначеного способу, що базується на визначенні частоти індукованих у статевих клітинах дрозофіли домінантних летальних мутацій (ДЛМ) за показником ембріональної смертності, є непевність у тому, що ембріональна смертність викликана саме домінантними леталями, а також можливі помилки при ідентифікації незапліднених яєць та ранніх ембріональних леталей. Технічною задачею корисної моделі є створення високоефективного та, водночас, простого і зручного у застосуванні способу визначення генотоксичної дії хімічного або фізичного чинника, що забезпечує достовірність не менше 95 %. Поставлена задача вирішується тим, що у способі [1, С. 270-271], вибраному за найближчий аналог, що передбачає дослідження частоти виникнення мутацій у Drosophila melanogaster Meig., згідно з корисною моделлю, як тесторну лінію використовують генетично нестабільну лінію Ваr (смужковидні очі), в якій після дії на самок хімічного або фізичного чинника у наступному поколінні досліджують частоту нерівного кросинговеру за мутаціями ознаки Ваr. Причинно-наслідковий зв'язок проявляється у тому, що генотоксична дія зовнішнього хімічного або фізичного чинника призводить до порушення взаємодії гомологічних хромосом під час мейозу, внаслідок чого збільшується частота нереципрокної гомологічної рекомбінації у локусі Ваr, результатом чого є збільшення частоти мутацій ознаки Ваr. Вибір лінії Ваr (смужковидні очі) як тесторної обумовлений явищем нереципрокної гомологічної рекомбінації, що спричиняє її генетичну нестабільність [2]. Як відомо, у дрозофіли близько 80 % так званих спонтанних мутацій виникає під впливом нестабільних елементів геному [3]. Мутація Ваr (В) (локалізація 1-57.0) - тандемна дуплікація локусу 16А1-16А7, фенотипово проявляється в редукції очей до вузької вертикальної смужки з кількістю фасеток біля 90 у самців та 70 у самок, на відміну від нормальної кількості біля 740 і 780 фасеток для самців і самок, відповідно [2]. Внаслідок рекомбінації між неправильно спарованими копіями генів в межах дуплікації Ваr утворюються нереципрокні рекомбінантні хромосоми з трьома D (Double Bar (B ), або Ultrabar (BB)) і однією (реверсія до нормального фенотипу) копіями гену відповідно. Особини з нереципрокними рекомбінантними хромосомами мають мутантний (В/+, BB/Y, ВВ/В) і нормальний (+/Y) фенотип. Самки В/+ мають біля 350 фасеток і виямку на передньому краї ока. У мутантів Double Bar (BB) кількість очних фасеток зменшена приблизно до 45 у гетерозигот ВВ/В і до 25 у гемізигот BB/Y. Частоту мутацій за локусом Ваr визначають за відношенням кількості мутантних подій +/Y, В/+, BB/Y, ВВ/В до загальної кількості проаналізованих особин лінії Ваr. Технічним результатом корисної моделі є створення способу визначення генотоксичної дії зовнішнього хімічного або фізичного чинника, у якому передбачено застосування впливу досліджуваного чинника на особин генетично нестабільної лінії Drosophila melanogaster та аналіз у наступному поколінні частоти мутацій за нестабільною фенотиповою ознакою. Спосіб здійснюють таким чином: Дія фізичного чи хімічного чинника може застосовуватися на різних стадіях онтогенезу дрозофіли: у ембріональній період, на стадії личинки, лялечки чи імаго. Хімічна речовина може додаватися у живильне середовище для личинок або (для жиророзчинних речовин) застосовуватися шляхом аплікації. У наступному поколінні, що розвивалося у стандартних умовах, досліджують частоту мутацій за локусом Ваr. Висновок про наявність чи відсутність мутагенної дії досліджуваного хімічного або фізичного чинника роблять на основі порівняння частоти мутацій у досліді відносно контролю, у якому подібного впливу не застосовували. Даний спосіб дозволяє визначити генотоксичну або можливу генопротекторну дію хімічного чи фізичного фактора, порівняти дію різних доз того чи іншого фактора, сумісну дію двох чи декількох факторів. 1 UA 90336 U 5 Приклади використання способу, що заявляється: Приклад 1. Метою дослідження було визначити за допомогою запропонованого способу генотоксичну дію різних концентрацій етанолу. Личинки лінії Ваr дрозофіли розвивалися у стандартному цукрово-дріжджовому середовищі з додаванням етанолу у об'ємних концентраціях 5,0 та 10,0 %. У наступному поколінні на стадії імаго досліджували частоту мутацій ознаки Ваr, спричиненої нереципрокною рекомбінацією у локусі Ваr. Отримані дані представлені у табл. 1. Таблиця 1 Частота мутацій ознаки Ваr внаслідок нереципрокної рекомбінації в лінії Ваr Drosophila melanogaster при дії різних об'ємних концентрацій етанолу Варіанти досліду Контроль, % Концентрація етанолу, % Концентрація етанолу, % Частота нерівного кросинговеру -3± -3 1,0·10 0,5·10 -3± -3 2,1·10 0,7·10 -3± -3 3,6·10 0,9·10 * 0,0 5,0 10,0 * - рівень значущості - р < 0,05 10 15 20 Отримані результати свідчать про зростання мутагенної дії етанолу за показником частоти мутацій ознаки Ваr у дрозофіли при збільшенні концентрації діючої речовини. З вірогідністю більше 95 % у об'ємній концентрації 10,0 % етанол спричиняє генотоксичну дію на геном дрозофіли. Приклад 2. Метою дослідження було визначити за допомогою запропонованого способу генотоксичну дію різних доз γ-опромінення. Досліди проводили на базі лінійного прискорювача КУТ-1, розробленого і створеного в ННЦ Харківський фізико-технічний інститут [4]. Опромінювалися віргінні самки імаго. Застосовували поглинені дози 8 і 25 Гр. У наступному поколінні на стадії імаго досліджували частоту мутацій ознаки Ваr, спричиненої нереципрокною рекомбінацією у локусі Ваr. Отримані дані представлені у табл. 2. Отримані результати свідчать про зростання мутагенної дії γ-опромінення за показником частоти мутацій ознаки Ваr у дрозофіли при збільшенні поглиненої дози. З вірогідністю більше 99,9 % при поглиненій дозі 25 Гр γ-опромінення спричиняє генотоксичну дію на геном дрозофіли, збільшуючи частоту нерівного кросинговеру на два порядки. 25 Таблиця 2 Частота мутацій ознаки Ваr внаслідок нереципрокної рекомбінації в лінії Ваr Drosophila melanogaster при дії різних поглинених доз γ-опромінення Варіанти досліду Контроль, Гр Поглинена доза, Гр Поглинена доза, Гр Частота нерівного кросинговеру -3± -3 0,9·10 0,3·10 -3± -3 1,2·10 0,5·10 -1± -1 1,4·10 0,3·10 * 0 8 25 * - рівень значущості - р < 0,001 30 Джерела інформації: 1. Тихомирова М. М. Генетический анализ. - Л.: издательство ЛГУ, 1990. - 280 с. 2. Sturtevant A. H. The effects of unequal crossing over at the bar locus in Drosophila//Genetics. 1925. - 10. - P. 117-147. 3. Гвоздев В. А. Подвижная ДНК эукариот. Ч. 1. Структура, механизмы перемещения и роль подвижных элементов в поддержании целостности хромосом // СОЖ. - 1998. - № 8. - С. 8-14. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб визначення генотоксичної дії хімічного або фізичного чинника, що передбачає дослідження частоти виникнення мутацій у Drosophila melanogaster Meig., який відрізняється тим, що як тесторну лінію використовують генетично нестабільну лінію Ваr (смужковидні очі), в 2 UA 90336 U якій після дії на самок хімічного або фізичного чинника у наступному поколінні досліджують частоту нерівного кросинговеру за мутаціями ознаки Вar. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3