Спосіб прогнозування ступеня важкості ротавірусного гастроентериту у дітей

Реферат: UA 90934 U UA 90934 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до області медицини, а саме епідеміології і інфектології, і може бути використана для прогнозування ступеню важкості ротавірусного гастроентериту (РГ) у дітей. Ротавіруси групи А є найбільш поширеною причиною тяжкого перебігу гастроентериту у дітей молодшого віку у всьому світі [1]. Кожного року реєструється більше 138 млн. випадків ротавірусного гастроентериту, при цьому у 111 млн. випадків інфекція має легкий перебіг і діти лікуються вдома, 25 млн. дітей мають середній ступінь важкості перебігу, коли дітям необхідна амбулаторна допомога, у 2 млн. дітей раннього віку ротавірусна інфекція (РІ) є причиною госпіталізацій; відзначається біля 600 тис. летальних випадків у дітей у віці до 5 років, при цьому до 80 % випадків смерті припадає на країни, що розвиваються [2, 3]. Однак, епідеміологічні дослідження показали, що і в економічно розвинутих країнах ця проблема стоїть гостро [3]. В Україні на долю РІ припадає від 35 до 75 % усіх випадків гострих кишкових інфекцій [4]. Показники захворюваності в окремі роки коливалися від 0,94 до 3,18 на 100 тис. населення. Однак, реальна захворюваність на гострий гастроентерит ротавірусної етіології значно перевищує ці показники через обмеження вірусологічної діагностики, а при змішаних віруснобактеріальних інфекціях зазвичай визначається лише бактеріальний збудник [5]. Найбільш близьким налогом до заявленої корисної моделі є спосіб діагностики ротавірусної інфекції, в якому визначають рівень інтерлейкінів - 1b, -2, -4, -6, -8, -10 та -12 сироватки крові дітей, хворих на ротавірусну інфекцію, після чого аналізують зв'язок між ступенем вираженості клінічних проявів та кількісним вмістом інтерлейкінів сироватки крові. В результаті мають просту констатацію факту зв'язку між кількісним вмістом інтерлейкінів та ступенем вираженості симптомів захворювання [6]. Однак основним недоліком вказаного способу є те, що він не дає можливості проводити диференційну діагностику між ротавірусною моно- та мікст-інфекцією, що призводить до неправильного призначення лікування, зокрема призначення антибіотиків. Відомо, що застосування антибіотиків при ротавірусній моноінфекції не тільки не ефективне, але й призводить до затягування одужання внаслідок розвитку дизбіотичних порушень мікрофлори кишечника, а при ротавірусній мікстінфекції, що обумовлена сполученням ротавірусу з патогенними або умовно-патогенними бактеріями, антибіотики показані, адже саме їх дія спрямована на елімінацію бактеріального компоненту захворювання. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалення способу прогнозування ступеня важкості ротавірусного гастроентериту у дітей шляхом додаткового до загальноклінічних досліджень генотипування методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) виділених ротавірусів групи А у пробах фекалій разом з розрахунком балів, отриманих при сумації клінічних і лабораторних показників, що дозволить з високим ступенем вірогідності прогнозувати ступінь важкості РГ у дітей, що, в свою чергу, дозволить своєчасно призначати адекватну терапію, скоротити число ускладнень і летальних наслідків. Поставлена задача вирішується тим, що згідно з корисною моделлю, додатково виконують генотипування методом ПЛР виділених ротавірусів групи А у пробах фекалій, за якими разом із розрахунком балів, отриманих по клінічних і лабораторних показниках, визначають ступінь важкості ротавірусного гастроентериту, а саме: при наявності генотипу G2P6 і оцінці вказаних балів від 1 до 4 встановлюють легкий ступінь РГ, при виділенні генотипів G3P8, G4P8, G2P4, G1P4 і кількості 3-8 балів виявляють середній ступінь важкості перебігу РГ, а при виявлені генотипу G1P8 і наявності балів більше 8 прогнозують важкий ступінь перебігу ротавірусного гастроентериту у дітей. Під наглядом знаходилося 3607 дітей у віці від 9 днів до 5 років, які були госпіталізовані в Одеську міську клінічну інфекційну лікарню з діагнозами: "Гострий гастроентерит" і "Гострий гастроентероколіт" (дані з 2007 р. до 2010 р.). Діагноз ротавірусної інфекції ставився на підставі сукупності клінічних, епідеміологічних даних, результатів параклінічних і бактеріологічних досліджень і даних ІФА (виявлення антигену ротавірусу штаму А). Генотипування ротавірусу групи А здійснювалося методом ПЛР 269 проб фекалій. Робота проводилася в референс-лабораторії Європейського регіонального бюро ВООЗ. Бактеріологічні дослідження виконували у спеціалізованій лабораторії міської інфекційної лікарні (м. Одеса). Статистична обробка проводилася методами дисперсійного, кореляційного та регресійного аналізу за допомогою програмного забезпечення Excel MS Office (США). Результати дослідження особливостей клінічного перебігу ротавірусного гастроентериту у хворих з різним генотипом збудника були піддані генотипуванню виділених ротавірусів групи А 1 UA 90934 U 5 10 15 20 25 30 методом полімеразної ланцюгової реакції при бактеріологічних дослідженнях фекальних випорожнень. Спосіб виконують наступним чином: - шар із лунки гнучкої пластини "Сокіл" (3912) з 100 мкл 1/10,000 протиротавірусної сироватки гиперімунної кролика (DAKO) розчинюють в 0,1 М карбонат-бікарбонатному буфері, рН 9,2; - інкубуйте при 37 °C протягом 2 годин. Промивають пластини 3 рази PBS-T; - блокують кожну лунку по 100 мкл 5 % SMP-PBS-T або протягом 2 год. при 37 °C чи протягом ночі при температурі 4 °C; - аспірують блокуючий розчин, а також добавляють 75 мкл 2,5 % SMP-PBS-T з 25 мкл зразка (пряжений супернатант від 10 % суспензії фекалій в BSS). Включають позитивний та негативний контроль, а також достатню кількість дублікатів проб для специфічних антитіл (чотири, наприклад, для серотипування (G1-G4); - аспірують фекальні зразки та промивають пластини 5 разів PBS-T; - додають 100 мкл відповідного розчинення МАТ (підгрупа або серотип-специфічних) в 2,5 % SMP-PBS-T. Необхідно інкубувати при 37 °C протягом 2,5 годин; - аспірувати розчинений МАТ, та вимити пластини 5 разів PBS-T. - додають 100 мкл HRPO-сполучених антимишиного IgG (Sigma) до відповідного розчинення в 2,5 % SMP-PBST. Оптимальне розведення серологічних реагентів буде обумовлено шахівницею титрування. Необхідно інкубувати при 37 °C протягом 1,5 год. WHO/IVB/08.1743; - аспірірувати HRPO і промити пластини 5 раз PBS-T; - додати 100 мкл свіжоприготованого субстрату: ТМВ (Sigma), 0,1 мг/мл+10 мл, 0,05 % М фосфат-цитратному буфері, рН 6,0, а 0,014 % перекису водню. - інкубувати при кімнатній температурі протягом 10 хв. Зупинити реакцію з 50 мкл 2МН2SО4. - читати пластини на планшеті ЕІА, використовуючи ОП при 450 нм (див. Фільтр 620 нм). Найбільша тривалість діареї спостерігалася у пацієнтів, в яких РГ був викликаний штамом із генотипом G1P8. При цьому при дослідженні частоти генотипу G1P8 у дітей різного віку встановлено, що він значно частіше зустрічався у дітей старших від 2 років (t=3,4; p0,05). Генотипи G4P8, G2P4, G1P8 та G1P4 у дітей різного віку зустрічалися з однаковою частотою. На підставі одержаних даних була розроблена схема прогнозування перебігу ротавірусного гастроентериту, придатна для визначення тривалості діареї та лихоманки протягом всього терміну захворювання (див. таблицю). 35 Таблиця Прогностична шкала для використання у пацієнтів з ротавірусною інфекцією Показники Тривалість діареї Тривалість лихоманки Наявність патогенної мікрофлори Наявність умовно-патогенної мікрофлори Геноти ротавірусу 40 45 1 бал 2 дні 2 дні Оцінка 2 бали 5 днів 5 днів 3 бали Більше 5 днів Більше 5 днів Немає До 100 КУО/мл Більше 100 КУО/мл До 100 КУО/мл До 1000 КУО/мл G2P6 G3P8, G4P8, G2Р4, G1P4 Більше 10000 КУО/мл G1P8 Отже, запропонований спосіб передбачає проведення стандартного обстеження відповідно до чинного протоколу із додатковим виконанням бактеріологічного дослідження фекальних випорожнень та виділення патогенної (шигелли, сальмонели) та умовно-патогенної (протей, клебсієла) флори, та при наявності мікстінфекції визначають важкість патологічного процесу за спеціально розробленою шкалою і співставляють з даними генотипування методом ПЛР. Отримані дані сумують та аналізують за наступним алгоритмом: при наявності генотипу G2P6 і оцінці вказаних балів від 1 до 4 встановлюють легкий ступінь РГ, при виділенні генотипів G3P8, G4P8, G2P4, G1P4 і кількості 3-8 балів виявляють середній ступінь важкості перебігу РГ, а при виявлені генотипу G1P8 і наявності балів більше 8 прогнозують важкий ступінь перебігу ротавірусного гастроентериту у дітей. 2 UA 90934 U 5 10 15 20 У порівняні з найближчим аналогом, запропонована корисна модель за рахунок додаткового до епідеміологічних, бактеріологічних і загальноклінічних досліджень виконання генотипування виділених ротавірусів групи А, дозволяє з точністю 93,6 % прогнозувати ступінь важкості ротавірусної інфекції, в тому числі при мікст-інфекції, своєчасно призначати адекватну терапію, скоротити число ускладнень, летальних виходів. Джерела інформації: 1. Hoa Tran TN, Trainor E, Nakagomi Т, Cunliffe NA, Nakagomi О. Molecular epidemiology of noroviruses associated with acute sporadic gastroenteritis in children: global distribution of genogroups, genotypes and GII.4 variants. J Clin Virol. 2013 Mar; 56(3): 185-93. 2. Chen SC, Tan LB, Huang LM, Chen KT. Rotavirus infection and the current status of rotavirus vaccines. J Formos Med Assoc. 2012 Apr; 111(4): 183-93. 3. Patton JT. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discov Med. 2012 Jan; 13(68):85-97 4. Малахов П.С. Эпидемиологические особенности ротавирусной инфекции в г. Одесса / П.С. Малахов, В.В. Бабиенко // Вісник проблем біології і медицини. - 2010, - N 3. - С. 84-91 5. Pereira LA, Ferreira СЕ, Turchetto GD, Nogueira MB, Vidal LR, Cruz CR, Debur MC, Almeida SM, Raboni SM. Molecular characterization of rotavirus genotypes in immunosuppressed and nonimmunosuppressed pediatric patients. J Pediatr (Rio J). 2013 May-Jun; 89(3):278-85 6. Jiang В., Snipes-Magaldi L., Dennehy P. at al. Cytokines as mediators for/oreffectors against rotavirus disease in children // Clinical and diagnostic laboratory immunology. - 2003. - № 12. P. 995-100. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб прогнозування ступеню важкості ротавірусного гастроентериту у дітей, що включає проведення епідеміологічних, бактеріологічних і загальноклінічних досліджень фекальних випорожнень, який відрізняється тим, що додатково виконують генотипування методом полімеразної ланцюгової реакції виділених ротавірусів групи А у пробах фекалій, за якими разом із розрахунком балів, отриманих по клінічних і лабораторних показниках, визначають ступінь важкості ротавірусного гастроентериту, а саме: при наявності генотипу G2P6 і оцінці вказаних балів від 1 до 4 встановлюють легкий ступінь РГ, при виділенні генотипів G3P8, G4P8, G2P4, G1P4 і кількості 3-8 балів виявляють середній ступінь важкості перебігу РГ, а при виявлені генотипу G1P8 і наявності балів більше 8 прогнозують важкий ступінь перебігу ротавірусного гастроентериту у дітей. 35 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3