Спосіб діагностики хронічної гранульоматозної хвороби

Реферат: Спосіб діагностики хронічної гранульоматозної хвороби включає дослідження венозної крові. При цьому досліджують відсотковий вміст гранулоцитів, що продукують реактивні кисневі сполуки під впливом стимуляції ліпополісахариду та зимозану, та окиснюють нефлуоресцентний дигідрородамін-123 до флуоресцентної сполуки родаміну-123, після чого за відсотковим вмістом активованих гранулоцитів в умовах експерименту під впливом стимуляції зимозану та ліпополісахарду діагностують хронічну гранульоматозну хворобу. UA 91620 U (54) СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ ХРОНІЧНОЇ ГРАНУЛЬОМАТОЗНОЇ ХВОРОБИ UA 91620 U UA 91620 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини, зокрема клінічної імунології, педіатрії, може бути використана для рутинної лабораторної діагностики пацієнтів з підозрою на хронічну гранульоматозну хворобу. Хронічна гранульоматозна хвороба (ХГХ) - первинний імунодефіцит, в основі якого лежить дефект НАДФН-оксидази - ензиму, відповідального за кисневий вибух і продукцію кисневих радикалів у фагоцитах. За відсутності активного ферменту кисневі радикали не продукуються, що призводить до порушення мікробіцидної функції фагоцитів. Такі хворі схильні до рецидивних бактеріальних і грибкових інфекцій [1]. Лабораторна діагностика ХГХ ґрунтується на визначенні активності кисневозалежної бактерицидної функції нейтрофілів. До діагностичних тестів належать: НСТ - тест - відновлення нітросинього тетразолію реактивними кисневими сполуками та метод дослідження оксидації дигідрородаміну-123 із використанням проточної цитометрії. За допомогою останнього визначається відсоток фагоцитів, які продукують реактивні кисневі сполуки (окислюють нефлуоресцентний дигідрородамін-123 (ДГР-123) до флуоресцентного компонентну - родаміну123). На відміну від тесту з дигідрородаміном-123, НСТ-тест часто призводить до хибнонегативних результатів та є більш суб'єктивний, так як підрахунок базується на мікроскопічному дослідженні обмеженої кількості клітин [2, 3]. Як комерційні активатори в тесті з ДГР-123, використовують бактеріальний формілпептид (fMLP), суспензію опсонізованої Е.соlі, як позитивний контроль - форбол-міристам ацетат (ФМА). Використання опсонізованої Е.соlі як активатора потребує використання додаткових флуоресцентних сполук, для відокремлення бактерій від клітин крові, що підвищує собівартість методу. Зимозан - біополімер дріжджової оболонки Saccharomyces cerevisiae, до складу якого входять в основному полісахариди. Основну біологічну активність зимозану визначають вуглеводи, зокрема глюкани. Показано, що зимозан активує гранулоцити - стимулює фагоцитоз, секрецію лізосомальних ферментів, утворення сполук реактивного кисню [4]. Ліпополісахарид (ЛПС) різноманітних патогенів добре відомий як потужний активатор імунних клітин, зокрема гранулоцитів. Показано, що інкубація з ЛПС призводить до активації кисневого вибуху гранулоцитів, підвищеної експресії адгезивних молекул та синтезу протимікробних сполук [5-7]. Таким чином, ЛПС та зимозан є надійними та потужними активаторами захисних функцій фагоцитів, зокрема ініціації кисневого вибуху, що дозволяє використовувати їх в тесті ДГР-123 для діагностики ХГХ. Відомий спосіб визначення резерву реактивності нейтрофілів (оксидантного потенціалу) [Пат. 2457488 C2 RU 05.05.2010], в якому резерв реактивності (оксидантний потенціал) нейтрофілів вимірюється наступним чином: проводять виміри світлосуми спонтанної хемілюмінесценції цільної розведеної крові в розчині люміналу, відразу після забору і через 4 години після її інкубації, потім проводять розрахунок різниці світлосуми (РРС) як різницю вимірів після 4 годин і виміру, проведеного відразу після забору крові, при цьому за норму значень РРС приймають 1-99 % відсотковий інтервал загального діапазону значень контрольної групи здоровий донорів; значення РРС нижче 1 % відсоткового інтервалу свідчить про зниження резерву реактивності нейтрофілів, значення, що перевищують 99 % інтервалу - свідчать про процес оксидантного стресу, альтерації клітин та розвитку деструктивного процесу. Недоліком способу є занадто широкий інтервал норми показників, що може давати хибнонегативні результати в дослідженні функціональної активності нейтрофілів, так як частково знижені показники, теж може бути свідченням дефектів системи гранулоцитів. Також, в методі, зміни активації відбуваються під впливом ендогенних субстанцій, що унеможливлює процес стандартизації та контролю процедури. Близьким, до об'єкта, що заявляється, є спосіб діагностики функціонального стану нейтрофілів людини [Пат. 2218567 С2 RU], в якому функціональний стан нейтрофілів людини визначається шляхом дослідження кисневозалежного метаболізму. Для цього попередньо виділяють нейтрофільні гранулоцити, ставлять реакцію відновлення нітросинього тетразолію в 96 лункових планшетах для імунологічних досліджень із наступною фіксацією результатів реакції за допомогою багатоканального фотометра. Функціональний стан оцінюють за рівнями спонтанної та індукованої активності, що вимірюється в одиницях оптичної густини. Як стимулятори використовують опсонізований та неопсонізований зимозан. Для кожного зразка визначають коефіцієнт активації як відношення індукованого рівня клітинної активації до спонтанного рівня активності, а за відношенням індукованого опсонізованим зимозаном рівня активності до індукованого неопсонізованим зимозаном рівня визначають коефіцієнт опсонізації. 1 UA 91620 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Основним недоліком вищенаведеного способу є тривалість та складність виконання способу. Попереднє виділення нейтрофілів може провокувати високі рівні спонтанної активності; також не аналізується стан інших популяцій гранулоцитів та моноцитів, що є важливим для діагностики ХГХ. В основу корисної моделі, що заявляється, поставлено задачу створення способу діагностики хронічної гранульоматозної хвороби, в якому визначається відсоток гранулоцитів, що продукують реактивні кисневі сполуки, після інкубації з активаторами - зимозаном та ліпополісахаридом, значне зниження відсотку активованих гранулоцитів свідчить про дефекти механізму кисневого вибуху, при цьому для виконання спосіб значно дешевший, так як не потребує використання опсонізованої Е.соlі та додаткових флуоресцентних сполук для розділення бактерій та клітин, та може використовуватись для більш точної діагностики. Поставлена задача вирішується шляхом дослідження венозної крові, при цьому, згідно з корисною моделлю, досліджується відсотковий вміст гранулоцитів, що продукують реактивні кисневі сполуки під впливом стимуляції ЛПС та зимозану, та окислюють нефлуоресцентний дигідрородамін-123 до флуоресцентної сполуки родаміну-123, причому відсотковий вміст активованих гранулоцитів в умовах експерименту під впливом стимуляції зимозану та ЛПС в діапазоні >75 % вважається нормальним, відсутність або значне зниження рівня активованих гранулоцитів(75 % вважається нормальним, відсутність або значне зниження рівня активованих гранулоцитів (