Штам бактерій rhizobium galegae для одержання бактеріального добрива під козлятник лікарський

Штам бактерій Rhizobium galegae, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України за номером ІMB В-7250, призначений для виготовлення бактеріального добрива під козлятник лікарський. Винахід відноситься до сільськогосподарської мікробіології, а саме до мікробіологічних засобів підвищення урожаю бобових культур, призначений для виробництва бактеріального добрива під козлятник лікарський. Козлятник лікарський є перспективним для використання в сільськогосподарському виробництві країни: він має високу зимостійкість, відзначається раннєстиглістю, інтенсивним ростом, здатністю до формування високого врожаю надземної маси та насіння. Рослинна сировина багата на аскорбінову кислоту, каротин, містить високу кількість протешу [1]. Проте широке застосування козлятника лікарського в агровиробництві України обмежене відсутністю районованих сортів та гібридів, а також розроблених біопрепаратів на основі активних штамів бактерій R. galegae для поліпшення азотного живлення та підвищення продуктивності культури [2]. За літературними джерелами бактерії R. galegae характеризуються високою специфічністю до рослини-господаря, тобто формують активний симбіоз лише з певним видом козлятника. Деякі автори розділяють вид R. galegae на два біовари: R. galegae bv. orientalis та R. galegae bv. officinalis, які є активними симбіонтами відповідно козлятника східного та козлятника лікарського [3]. На сьогодні в Україні не існує бактеріального добрива для підвищення урожайності козлятника лікарського на основі активних штамів бульбочкових бактерій. Відомі штами R. galegae MC-1, R. galegae 913, R. galegae K-3, які сприяють зростанню продуктивності козлятника східного [4]. Однак використання зазначених штамів для інокуляції козлятника лікарського сприяє формуванню неефективного симбіозу, призводить до зниження азотфіксувальної активності та урожайності культури. Завданням винаходу є одержання нового ефективного штаму бульбочкових бактерій козлятника, який би мав високу специфічність до козлятника лікарського, посилював процес симбіотичної азотфіксації і забезпечував підвищення продуктивності даної культури. (19) UA (11) 91635 (13) (21) a200901041 (22) 10.02.2009 (24) 10.08.2010 (46) 10.08.2010, Бюл.№ 15, 2010 р. (72) ВОРОБЕЙ ВОЛОДИМИР СТЕПАНОВИЧ, КОВАЛЕВСЬКА ТАМАРА МИХАЙЛІВНА, НАДКЕРНИЧНА ОЛЕНА ВОЛОДИМИРІВНА, РАХМЕТОВ ДЖАМАЛ БАХЛУЛ ОГЛИ, СТАДНІЧУК НІНА ОЛЕКСАНДРІВНА (73) ІНСТИТУТ СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКОЇ МІКРОБІОЛОГІЇ УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК, НАЦІОНАЛЬНИЙ БОТАНІЧНИЙ САД ІМЕНІ М.М. ГРИШКА НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (56) UA C2 51890, 15.11.2004. RU C1 2025472, 30.12.1994. RU C1 2061666, 10.06.1996. LV A 12157, 20.11.1998. C2 1 3 91635 Поставлене завдання вирішується таким чином: методом аналітичної селекції отримано новий штам бульбочкових бактерій Rhizobium galegae, який в симбіозі з козлятником лікарським активно фіксує атмосферний азот, покращує розвиток рослин, підвищує продуктивність даної культури і може бути біоагентом мікробного препарату. Заявлений штам Rhizobium galegae виділений з бульбочок козлятника лікарського сорту Гарант, який вирощувався на дослідних ділянках Національного ботанічного саду ім. М.М. Гришка HAH України. Тип ґрунту - темно-сірий, опідзолений. Штам Rhizobium galegae ідентифікований за визначником Берджі [5] і йому привласнений номер Л-13. Штам бактерій Rhizobium galegae Л-13 депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України під реєстраційним номером Rhizobium galegae 1MB В-7250, а також зберігається в колекції корисних ґрунтових мікроорганізмів Інституту сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук під реєстраційним номером Rhizobium galegae B-218, призначений для виготовлення бактеріального добрива під козлятник лікарський. Морфолого-культуральні властивості штаму. Штам Rhizobium galegae Л-13 добре росте на рідкому та твердому поживному середовищі такого складу (г/л): цукроза - 10,0; гороховий відвар 100,0; агар-агар - 20,0; рН - 6,5 - 7,0. Стерилізація середовища 1,0атм 30хв. В рідкому середовищі культура вирощується на качалках при 220об/хв. Оптимальна температура росту – 28 С, рН - 6,56,8. На агаризованому гороховому середовищі колонії на 3-4 добу росту помірно опуклі, слизисті, напівпрозорі, округлої форми, діаметром 2-4мм. Штрих на зазначеному середовищі слизистий, напівпрозорий, помірно опуклий. Клітини мають форму злегка зігнутих паличок, рухливі. Бактерії не утворюють спор, за Грамом не забарвлюються. Культура швидкоросла. Фізіолого-біохімічні властивості штаму. Аероб. Молоко з лакмусом не пептонізує, підвищує рН середовища до лужного, на поверхні молока утворює слизисту зону. На м'ясопептонному агарі та м'ясо-пептонному бульйоні не росте. Здатний до дисоціації. Відношення до джерел вуглецю. Штам активно асимілює глюкозу, арабінозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, маніт, дульцит з підкисленням середовища. Не засвоює сорбіт. 4 Відношення до джерел азоту. Штам добре росте на середовищах з амонійними солями, азотнокислим калієм та натрієм. Переважно використовує відновлені форми азоту. Пригнічення росту бактерій спостерігається при культивуванні на синтетичному середовищі в присутності органічних сполук азоту (сечовини та аспарагіну). Штам чутливий до більшості досліджених антибіотиків (норфлоксацину, еритроміцину, поліміксину, цефотаксиму, ципрофлоксацину, левоміцетину, канаміцину, гентаміцину, ампіциліну, фурадоніну), не чутливий до оксациліну. Штам відноситься до швидкорослих бульбочкових бактерій. В симбіозі з козлятником лікарським штам здатний до активної фіксації молекулярного азоту, формуючи на коренях рослин рожеві бульбочки. На коренях козлятника східного під впливом даного штаму утворюються малоактивні бульбочки білого кольору. Штам патогенних властивостей не має (належить до групи авірулентних мікроорганізмів, не здатних до інвазії у внутрішні органи теплокровних тварин). Ознаки штаму стійкі. Штам зберігається на агаризованому гороховому середовищі при 4-5 С. Пересів проводиться один раз в 6 місяців. Ефективність штаму Rhizobium galegae Л-13 перевіряли у вегетаційному та польових дослідах. Приклади конкретного застосування штаму. Приклад 1. В умовах вегетаційного досліду (ґрунт - дерново-підзолистий супіщаний, рН сольове - 6,5; вміст гумусу - 0,8-1,1%; азоту, що легко гідролізується - 56-57 мг; Р2О5 - 160-170мг і К2О - 100-110мг на 1кг ґрунту) вивчали ефективність інокуляції козлятника лікарського досліджуваним штамом Л-13. Повторність досліду - чотириразова. Активність симбіотичної азотфіксації визначали ацетилен-етиленовим методом [6] на газовому хроматографі "Chrom-4". Перед посівом насіння скарифікували та обробляли суспензією штаму Л-13 з бактеріальним навантаженням 200-300 тис. бактерій на насінину та висаджували у пластикові посудини, що містять 1кг ґрунту. У контрольному варіанті насіння змочували водою. Тривалість досліду 80 діб. Протягом вегетації рослин вологість ґрунту підтримували на рівні 60% від повної вологоємкості. Одержані результати свідчать про високу ефективність штаму Л-13 щодо козлятника лікарського, який сприяє підвищенню симбіотичної азотфіксації та продуктивності рослин відносно контролю (табл. 1). Таблиця 1 Вплив штаму R. galegae Л-13 на формування кореневих бульбочок козлятника лікарського, їх активність та урожайність культури Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Інокуляція R. galegae шт. Л-13 НІР05 Кількість бульбочок, од./рослину 68,45 Азотфіксувальна активність, мкг Суха надземна маса, N/рослину за годину г/рослину 7,34 0,56 138,25 9,16 0,66 12,93 0,71 0,05 5 91635 Приклад 2. В польовому досліді на базі Національного ботанічного саду ім. М.М. Гришка HAH України (ґрунт - темно-сірий, опідзолений, слабо змитий, рН сольове - 5,0-6,0, водне - 6,1-6,8, вміст гумусу до 2,8%, NH4 - 100мг; Р2О5 - 223мг і К2О 84мг на 1кг ґрунту) вивчали вплив бактеризації насіння штамом Л-13 на ріст та розвиток козлятника лікарського сорту Гарант. Передпосівну обробку проводили препаратом, який складався із субстрату (торфу) та інокулюму (R. galegae шт. Л-13). Торф висушували, просівали через сито та подрібнювали так, щоб розмір часток не перевищував 0,1мм. Подрібнений торф зволожували до 35-40%, нейтралізували крейдою, розфасовували у поліпропіленові пакети по 300г і автоклавували при 1,5атм протягом 1 години. Після автоклавування пакети інокулювали культурою бактерій R. galegae шт. Л-13 з титром 3,0-3,5млрд. клітин на 1мл середовища та зберігали при температурі 5-8 С. В день посіву проводили бактеризацію насіння козлятника лікарського препаратом із розрахунку 300г на гектарну норму насіння. Як свідчать дані фенологічних спостережень, сходи козлятника лікарського у варіанті з інокуля 6 цією штамом Л-13 з'явилися на 4-6 діб раніше, ніж у контрольному варіанті досліду. Оброблені препаратом на основі запропонованого штаму рослини за усіма морфометричними показниками значно перевищували рослини без інокуляції як в перший, так і другий роки вирощування (табл. 2). Бактеризація козлятника лікарського сприяла збільшенню олистненості, кращому розвитку кореневої системи та надземної частини рослин. В перший рік вирощування 40% рослин у варіанті з обробкою штамом Л-13 досягли генеративної фази та сформували суцвіття довжиною від 6 до 12см. На другий рік життя рослини цього варіанту вступили у фази відростання, бутонізації і цвітіння на 5-7 діб раніше, ніж контрольні рослини. Як свідчать дані, наведені в таблиці 3, передпосівна обробка насіння козлятника лікарського штамом Л-13 забезпечувала зростання насіннєвої продуктивності культури. Рослини даного варіанту досліду мали більшу кількість бобів як на головному пагоні, так і на бічних пагонах першого порядку, а також більшу масу насіння. Таблиця 2 Вплив інокуляції насіння штамом R. galegae Л-13 на ріст і розвиток козлятника лікарського с. Гарант в перший та другий роки життя Варіанти Контроль (без інокуляції) Інокуляція R. galegae шт. Л-13 Висота рослин, см Кількість, Довжина міжод./рослину вузля, см пагонів листків Перший рік життя Маса, г надземна коріння 47 1,4 4,3 0,34 3,0 1,0 35,5 0,7 54 4,0 22,0 1,5 62 0,7 5,0 0,5 6,5 0,5 112 2,0 125 5,0 38 2,4 Другий рік життя Контроль (без інокуляції) Інокуляція R. galegae шт. Л-13 87,5 1,3 6,0 0,8 8,5 0,9 143,0 4,0 230,0 38,0 2,0 115,0 3,5 7,9 0,4 12,7 0,7 178,8 4,5 310,0 43,3 4,4 Таблиця 3 Основні показники насіннєвої продуктивності козлятника лікарського у другий рік життя Варіанти Контроль (без інокуляції) Інокуляція R. galegae шт. Л-13 Кількість з 10 продуктивних пагонів, од. бобів насінин Маса 1000 насінин, г Маса насіння, г/м2 935,5 23,0 1240,0 17,5 6,3 27,4 1,2 1060,0 14,0 1673,0 16,4 6,74 38,6 2,7 Таким чином, встановлено, що визначальним фактором активного росту рослин козлятника лікарського є інокуляція штамом Л-13, що позитивно впливає на розвиток кореневої системи, сприяє збільшенню урожаю надземної маси та забезпечує значний приріст високоякісного насіння. Приклад 3. В польовому досліді на базі ІСГМ УААН (ґрунт -дерново-підзолистий супіщаний, рН сольове - 6,5; вміст гумусу - 0,8-1,1%; азоту, що легко гідролізується - 56-57мг; Р2О5 - 160-170мг і К2О - 100-110мг на 1кг ґрунту) протягом двох років вирощування козлятника лікарського вивчали 7 91635 ефективність штаму Л-13 щодо даної культури. Перед посівом насіння козлятника скарифікували та інокулювали досліджуваним штамом із розрахунку 200-300тис. бактеріальних клітин на насінину. В контрольному варіанті насіння змочували водою. 8 Встановлено, що штам Л-13 є активним симбіонтом козлятника лікарського. За інокуляції рослин цим штамом на коренях рослин формуються чисельні бульбочки, які характеризуються високою здатністю до фіксації атмосферного азоту (табл. 4). Таблиця 4 Вплив бактеризації козлятника лікарського штамом R. galegae Л-13 на формування кореневих бульбочок та їх активність протягом першого та другого років вирощування. Середня кількість бульбочок, од. на росли- Азотфіксувальна активність, мкг N /рослину ну за годину 1-й рік вирощування 2-й рік вирощування 1-й рік вирощування 2-й рік вирощування Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Інокуляція R. galegae шт. Л-13 НІР05 0,63 193,75 0,69 26,96 90,50 392,50 11,22 70,81 13,13 35,02 4,80 9,40 Штам Л-13 підвищує інтенсивність процесу фотосинтезу як в перший, так і другий роки вирощування козлятника лікарського, про що свідчить зростання вмісту хлорофілу а і b в листках інокульованих рослин. Досліджуваний штам збільшує загальний вміст хлорофілів відносно контролю в перший рік на 78,0%, на другий рік - 35,5% (табл. 5). Інокуляція рослин досліджуваним штамом сприяла зростанню продуктивності козлятника лікарського протягом двох років використання (табл. 6). Штам Л-13 забезпечив приріст урожаю сухої надземної маси рослин відносно контролю в перший рік на 58,6%, на другий рік - 16,6 %. В цілому зростання продуктивності культури у сумі за два роки вирощування порівняно до контролю становить 37,4%. Таблиця 5 Вміст хлорофілу в біомасі листя козлятника лікарського (перший та другий роки вирощування). Варіанти досліду Хлорофіл а, мг/100г Контроль (без інокуляції) Інокуляція R. Galegae шт. Л-13 HIР05 1-й рік вирощування Хлорофіл сума хлорофілів b, а і b, мг/100г мг/100г Хлорофіл а, мг/100г 2-й рік вирощування Хлорофіл сума хлорофілів b, а і b, мг/100г мг/100г 121,26 39,02 160,28 143,79 41,14 184,93 177,59 107,72 285,31 204,47 46,02 250,49 27,85 15,07 14,84 6,61 Таблиця 6 Ефективність застосування штаму R. galegae Л-13 для передпосівної обробки насіння козлятника лікарського. Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Інокуляція R. galegae шт. Л-13 HIР05 Урожайність сухої надземної маси, т/га, у сумі за 2 роки 1-й рік вирощування 2-й рік вирощування вирощування Приріст урожаю до контролю у сумі за 2 роки, % 4,73 4,83 9,56 7,50 5,63 13,13 37,34 0,80 0,48 Отже, штам R. galegae Л-13 є активним симбіонтом козлятника лікарського. За інокуляції культури даним штамом зростає чисельність кореневих бульбочок, їх нітрогеназна активність, що забезпечує рослини необхідним для росту та розвитку зв'язаним азотом. Це сприяє зростанню вмісту хлорофілів в листках рослин, підвищенню уро 9 91635 жайності надземної маси, зростанню кількості та якості насіння. Література: 1. Утеуш Ю.А., Лобас М.Г. Кормові ресурси флори України. - К.: Наук, думка, 1996. - 222с. 2. Нові кормові, пряно смакові та овочеві інтродуценти в Лісостепу і Поліссі України /Рахметов Д.Б., Стаднічук Н.О., Корабльова О.А., Смілянець Н.М. та інші. - К.: Фітосоціоцентр, 2004. - 263с. 3. Andronov E.E., Terefework Z., Roumiantseva M.L. et al. Symbiotic and genetic diversity of Rhizobium galegae isolates collected from the Galega orientalis gene center in the Caucasus. //Appl. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 10 Environ. Microbiol. - 2003. - Vol. 69, №2. - P.10671074. 4. Заболотна В.П. Особливості симбіотичної азотфіксації і продуктивність козлятнику східного: Автореф. дис. ... канд. біол. наук. - К., 2002. - 20с. 5. Определитель бактерий Берджи: В 2т.: Пер. с англ. /Под ред. Дж. Хоулта, И. Крига, П. Снита и др. - М: Мир, 1997. - Т. 1. - 432с. 6. Волкогон В.В. Методичні рекомендації по визначенню азотфіксації в ґрунті та кореневій зоні рослин ацетиленовим методом. - Чернігів, 1997. 14с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601