Штам бактерій rhizobium leguminosarum bv. viceae m1 для одержання бактеріального добрива під горох

Штам бактерій Rhizobium leguminosarum bv. viceae М1, депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України як Rhizobium leguminosarum bv. viceae ІMB B-7195, для одержання бактеріального добрива під горох. (19) (21) a200611360 (22) 30.10.2006 (24) 10.01.2008 (72) КОЦЬ СЕРГІЙ ЯРОСЛАВОВИЧ, UA, МАНДРОВСЬКА НАТАЛІЯ МИХАЙЛІВНА, UA, КРУГОВА ОЛЕНА ДМИТРІЇВНА, UA (73) ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ НАН УКРАЇНИ, UA (56) UA 21012 A, 27.02.1998 UA 3325 C1, 27.12.1994 3 культурально-морфологічними ознаками: культура бактерій не спороносна, грам-негативна, рухлива. Розмір клітин 0,8-2,3мкм. Клітини мають палочковидну форму, пігмент не продукують. Культура швидкоросла. Штам М1 росте на таких поживних середовищах: бобовому агарі Мазе (г/л: горох 100,0; сахароза - 20,0; агар - 15,0; рН середовища 6,8-7,6), мінеральному (г/л: - К2НРО4 - 1,0; КН2РО4 - 1,0; FeCl3×6H2O - 0,01; MgSO4×7Н2О - 0,25; СаСд2×6Н2О - 0,1; KNO3 - 0,6; маніт - 10,0; агар 15,0; рН - 7,2.) На 3-ю добу росту штрихом утворює білувато-кремові колонії діаметром 0,10,3см, помірно опуклі, напівпрозорі, з рівними краями. Температура інкубації 27-28°С. Для довгострокового зберігання штаму М1 використовується середовище 79 (г/л: К2НРО4 0,5; MgSO4×7 Н2О - 0,2; NaCl - 0,1; СаСО3 - сліди, дріжджовий екстракт - 2, казамінові кислоти або лактальбумін - 0,5; маніт - 10; рН середовища 7,2-7,4; стерилізація при 0,8-1,0атм. 30хв., t° культивування - 28°С. Пересів через 2-3 місяці. При розсіві штрихом на 3-ю добу з'являються однотипні, слизисті, білуваті колонії до 0,4см у діаметрі. Фізіолого-біохімічні властивості. Симбіонт. Макросимбіонт - бобова рослина горох (Pisum sativum L.). Відношення до кисню: аероб. Температурний діапазон росту: 20-30°С. Діапазон рН 6,8-7,6. Оптимальна рН - 7,3. Джерелами вуглецю для штаму М1 можуть бути моно-, ди-, трисахариди та сахароспирти. З моносахаридів штам добре використовує арабінозу, глюкозу, ксилозу та рамнозу. Штам М1 асимілює дисахариди лактозу, мальтозу, сахарозу, трисахарид - рафінозу та сахароспирти маніт і сорбіт. Штам не засвоює сорбозу, інозитол, декстрин. Поряд із засвоєнням азоту атмосфери штам М1 може використовувати амонійний та нітратний азот, пептонізувати молоко. Пропонований штам крохмаль не гідролізує, не виділяє сірководень, не росте на м'ясопептонному агарі, не розріджує желатину. Генетичні особливості штаму. Протроф. Стійкий до ряду антибіотиків. На відміну від прототипу - штаму 2636 він набув здатність стійкості до канаміцину в дозі 200мкг/мл і стрептоміцину 600мкг/мл. Штам не патогенний (Заключения Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ щодо патогенних властивостей штаму за результатами дослідження вірулентності від 27.06.06.). Симбіотичні властивості штаму. Оцінку симбіотичних властивостей штаму М1 азотфіксувальної активності та ефективності симбіозу проводили в умовах вегетаційних та польових дослідів у 2003-2006 роках. Приклад Вегетаційні досліди проводили на промитому річковому піску, (суміш Гельрігеля з 0,25 нормою азоту). Використовували 8кг посудини Вагнера. Насіння гороху сорту Дамір2 стерилізували 70% етанолом, промивали дистильованою водою та 81577 4 інокулювали бульбочковими бактеріями з розрахунку не менше 1,0×109 клітин на 1мл суспензії. Стерильне насіння витримували в суспензії бактерій протягом 2 год. і висівали у посудини. Абсолютним контролем були неінокульовані рослини. У дослідах визначали азотфіксувальну активність за редукцією ацетилену в етилен, масу рослин, кількість бульбочок і урожай насіння на посудину. Польові досліди проводили у 2004-2006 pp. у дослідному господарстві Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (смт. Глеваха, Васильківського району, Київської області) на світло-сірих опідзолених легко-суглинистих грунтах, рН 6,0-6,7, вмістом гумусу 1,6-1,7%, азоту - 13,6мг/кг, Р2О5 - 36,6мг/кг, К2О - 134мг/кг. Посів гороху у польових дослідах проводили у другій декаді квітня, облікова площа ділянки 5м2, повторність досліду 4-кратна. Посів рендомізований. Азотні добрива не вносили. За даними вегетаційних дослідів 2003-2004 pp. (табл. 1) штам Μ1 утворював ефективний симбіоз із рослинами гороху, активно фіксував атмосферний азот і перевищував штам-прототип у фазу бутонізації у середньому в 1,4 рази. За відношенням до спонтанної інокуляції його азотфіксувальна активність була вищою у 3,1-3,4 рази. Новий штам бульбочкових бактерій гороху М1 підвищував урожай зерна на 29% до контролю і на 21% до штаму-прототипу 2636. Результати ефективності запропонованого штаму М1 у польових дослідах наведені в табл. 24. Штам, що пропонується, за ефективністю суттєво перевищує штам-прототип 2636 і виробничий штам 245а. Новий штам протягом усього періоду досліджень достовірно підвищував урожай зерна. За даними табл. 2 у польових умовах 2004 р. інокуляція штамом М1 позитивно впливала на азотфіксувальну активність бульбочок та наростання надземної маси рослин гороху. Так, за азотфіксувальною активністю пропонований штам перевищував прототип 2636 майже у 2 рази, а за прирістом надземної маси на 17,5%. Досліджуваний штам М1 сприяв підвищенню урожаю зерна сорту Дамір 2 порівняно з контролем без інокуляції на 28,2%, і на 11% порівняно з штамом-прототипом (табл. 3), що становило 7,9 і 3,6ц/га відповідно. У польових дослідах 2006 року штам М1 із сортом гороху Камелот забезпечував збільшення урожаю зерна на 44,2% порівняно до контролю без інокуляції, на 15,0% порівняно зі штамом 2636 і на 17,4% порівняно зі виробничим штамом, що відповідно становило 12,2, 5,2 і 5,9ц/га. Показники ефективності симбіозу гороху з новим штамом М1 у Варіант Азотфіксувальна активність, мкмоль С2Н4/ (росл. год) Урожай за повторностями, г/посудину 1 2 3 4 5 1 Контроль Штам-прототип 2 2636 Запропонований 3 штам M1 81577 6 0,923±0,044 15,0 15,3 16,0 15,7 15,5±0,2 2,189±0,113 16,1 16,7 16,9 16,3 16,5±0,2 3,102±0,141 19,7 19,9 20,1 20,3 20,0±0,1 4,5 29,0 3,5 21,2 Таблиця 2 Вплив штамів бульбочкових бактерій Rhizobium leguminosarum bv. viceae на азотфіксувальну активність бульбочок та приріст надземної маси рослин гороху у фазу бутонізації (польовий дослід, 2004 р.) Приріст до Приріст до Азотфіксувальна Надземна маса за повторностями, активність, Середнє контролю штаму 263б г/рослину мкмоль г % г % С2Н4/(росл. год) 28,3; 29,4; 29,8; 27,5; 28,1 28,6 0,83±0,04 Варіант Контроль Штам-прототип 263б 31,9 35,1; 39,9; 36,8; 38,3; 37,3 Запропонований штам М1 НІР05 30,1; 34,8; 31,0; 31,9; 31,9 2,11±0,12 37,5 8,9 31,1 5,6 17,5 4,09±0,10 2,1 Таблиця 3 Вплив передпосівної інокуляції насіння штамом М1 на урожай зерна гороху (польовий дослід 2004 р.) Варіант Контроль Штам-прототип 263б Запропонований штам М1 НІР05 Урожай за повторностями, ц/га 1 2 3 4 25,5 22,2 33,0 31,3 34,7 34,2 33,6 26,6 35,9 36,2 36,5 Середній урожай, ц/га Надбавка до контролю ц/га % Надбавка до штаму 263б ц/га % 7,9 3,6 28,0±2,5 32,3±1,9 35,0 35,9±0,3 28,2 11,1 2,1 Таблиця 4 Урожай зерна гороху сорту Камелот при інокуляції новим штамом М1 (польовий дослід, 2006 р.) Варіант Контроль Виробничий штам 245а Штам-прототип 263б Запропонований штам М1 НІР05 Урожай за повторностями, 1 2 3 28,3 27,3 27,2 4 27,6 ц/га Середній урожай, ц/га Надбавка до Надбавка до Надбавка до контролю штаму 245а штаму 263б ц/га % ц/га % ц/га % 27,6±0,3 30,6 33,5 33,9 37,7 33,9±1,5 34,3 37,2 32,0 35,0 34,6±1,1 38,6 39,8 39,0 41,8 39,8±0,7 Таким чином, у результаті проведених вегетаційних і польових дослідів встановлено, що інокуляція новим штамом М1 підвищує ефективність симбіотичної азотфіксації порівняно зі штамом-прототипом і виробничим, та позитивно впливає на збільшення врожаю зерна гороху. Культура є ефективним симбіонтом сортів гороху Дамір 2, Менгір, Камелот. 2,2 12,2 44,2 5,9 17,4 5,2 15,0