Штам бактерій rhizobium galegae для одержання бактеріального добрива під козлятник лікарський

Штам бактерій Rhizobium galegae, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України за номером IMB В-7250, призначений для виготовлення бактеріального добрива під козлятник лікарський. (19) (21) u200901042 (22) 10.02.2009 (24) 25.08.2009 (46) 25.08.2009, Бюл.№ 16, 2009 р. (72) ВОРОБЕЙ ВОЛОДИМИР СТЕПАНОВИЧ, КОВАЛЕВСЬКА ТАМАРА МИХАЙЛІВНА, НАДКЕРНИЧНА ОЛЕНА ВОЛОДИМИРІВНА, РАХМЕТОВ ДЖАМАЛ БАХЛУЛ ОГЛИ, СТАДНІЙЧУК НІНА ОЛЕКСАНДРІВНА 3 русології НАН України під реєстраційним номером Rhizobium galegae 1MB В-7250, а також зберігається в колекції корисних ґрунтових мікроорганізмів Інституту сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук під реєстраційним номером Rhizobium galegae B-218, призначений для виготовлення бактеріального добрива під козлятник лікарський. Морфолого-культуральні властивості штаму. Штам Rhizobium galegae Л-13 добре росте на рідкому та твердому поживному середовищі такого складу (г/л): цукроза 10,0 гороховий відвар 100,0 агар-агар 20,0 рН 6,5-7,0. Стерилізація середовища 1,0атм 30хв. В рідкому середовищі культура вирощується на качалках при 220 об/хв. Оптимальна температура росту – 28°С, рН - 6,5-6,8. На агаризованому гороховому середовищі колонії на 3-4 добу росту помірно опуклі, слизисті, напівпрозорі, округлої форми, діаметром 2-4мм. Штрих на зазначеному середовищі слизистий, напівпрозорий, помірно опуклий. Клітини мають форму злегка зігнутих паличок, рухливі. Бактерії не утворюють спор, за Грамом не забарвлюються. Культура швидкоросла. Фізіолого-біохімічні властивості штаму. Аероб. Молоко з лакмусом не пептонізує, підвищує рН середовища до лужного, на поверхні молока утворює слизисту зону. На м'ясопептонному агарі та м'ясо-пептонному бульйоні не росте. Здатний до дисоціації. Відношення до джерел вуглецю. Штам активно асимілює глюкозу, арабінозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, маніт, дульцит з підкисленням середовища. Не засвоює сорбіт. Відношення до джерел азоту. Штам добре росте на середовищах з амонійними солями, азотнокислим калієм та натрієм. Переважно використовує відновлені форми азоту. Пригнічення росту бактерій спостерігається при культивуванні на синтетичному середовищі в присутності органічних сполук азоту (сечовини та аспарагіну). Штам чутливий до більшості досліджених антибіотиків (норфлоксацину, еритроміцину, поліміксину, цефотаксиму, ципрофлоксацину, левоміцетину, канаміцину, гентаміцину, ампіциліну, фурадоніну), не чутливий до оксациліну. Штам відноситься до швидкорослих бульбочкових бактерій. В симбіозі з козлятником лікарським штам здатний до активної фіксації молекулярного азоту, формуючи на коренях рослин рожеві бульбочки. На коренях козлятника східного під впливом даного штаму утворюються малоактивні бульбочки білого кольору. Штам патогенних властивостей не має (належить до групи авірулентних мікроорганізмів, не здатних до інвазії у внутрішні органи теплокровних тварин). Ознаки штаму стійкі. Штам зберігається на агаризованому гороховому середовищі при 4-5°С. Пересів проводиться один раз в 6 місяців. 43516 4 Ефективність штаму Rhizobium galegae Л-13 перевіряли у вегетаційному та польових дослідах. Приклади конкретного застосування штаму. Приклад 1. В умовах вегетаційного досліду (ґрунт - дерново-підзолистий супіщаний, рН сольове - 6,5; вміст гумусу - 0,8-1,1%; азоту, що легко гідролізується - 56-57мг; Р2О5 - 160-170мг і К2О - 100-110мг на 1кг ґрунту) вивчали ефективність інокуляції козлятника лікарського досліджуваним штамом Л-13. Повторність досліду - чотириразова. Активність симбіотичної азотфіксації визначали ацетиленетиленовим методом [6] на газовому хроматографі "Chrom-4". Перед посівом насіння скарифікували та обробляли суспензією штаму Л-13 з бактеріальним навантаженням 200-300тис. бактерій на насінину та висаджували у пластикові посудини, що містять 1 кг ґрунту. У контрольному варіанті насіння змочували водою. Тривалість досліду 80 діб. Протягом вегетації рослин вологість ґрунту підтримували на рівні 60% від повної вологоємкості. Одержані результати свідчать про високу ефективність штаму Л-13 щодо козлятника лікарського, який сприяє підвищенню симбіотичної азотфіксації та продуктивності рослин відносно контролю (табл. 1). Таблиця 1 Вплив штаму R. galegae Л-13 на формування кореневих бульбочок козлятника лікарського, їх активність та урожайність культури Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Інокуляція R. galegae шт. Л-13 HIP05 Кількість бульбочок, од./рослину Азотфіксувальна Суха активність, мкг надземна N/рослину за маса, годину г/рослину 68,45 7,34 0,56 138,25 12,93 9,16 0,71 0,66 0,05 Приклад 2. В польовому досліді на базі Національного ботанічного саду ім. М.М.Гришка HAH України (ґрунт - темно-сірий, опідзолений, слабо змитий, рН сольове - 5,0-6,0, водне - 6,1-6,8, вміст гумусу до 2,8%, NH4 -100мг; Р2О5 - 223мг і К2О - 84мг на 1кг ґрунту) вивчали вплив бактеризації насіння штамом Л-13 на ріст та розвиток козлятника лікарського сорту Гарант. Передпосівну обробку проводили препаратом, який складався із субстрату (торфу) та інокулюму (R. galegae шт. Л-13). Торф висушували, просівали через сито та подрібнювали так, щоб розмір часток не перевищував 0,1мм. Подрібнений торф зволожували до 35-40%, нейтралізували крейдою, розфасовували у поліпропіленові пакети по 300г і автоклавували при 1,5атм протягом 1 години. Після автоклавування пакети інокулювали культурою бактерій R. galegae шт. Л-13 з титром 3,0-3,5млрд. клітин на 1мл середовища та зберігали при температурі 5-8°С . В день посіву проводили бактериза 5 43516 цію насіння козлятника лікарського препаратом із розрахунку 300г на гектарну норму насіння. Як свідчать дані фенологічних спостережень, сходи козлятника лікарського у варіанті з інокуляцією штамом Л-13 з'явилися на 4-6 діб раніше, ніж у контрольному варіанті досліду. Оброблені препаратом на основі запропонованого штаму рослини за усіма морфометричними показниками значно перевищували рослини без інокуляції як в перший, так і другий роки вирощування (табл. 2). Бактеризація козлятника лікарського сприяла збільшенню олистненості, кращому розвитку кореневої системи та надземної частини рослин. 6 В перший рік вирощування 40% рослин у варіанті з обробкою штамом Л-13 досягли генеративної фази та сформували суцвіття довжиною від 6 до 12см. На другий рік життя рослини цього варіанту вступили у фази відростання, бутонізації і цвітіння на 5-7 діб раніше, ніж контрольні рослини. Як свідчать дані, наведені в таблиці 3, передпосівна обробка насіння козлятника лікарського штамом Л-13 забезпечувала зростання насіннєвої продуктивності культури. Рослини даного варіанту досліду мали більшу кількість бобів як на головному пагоні, так і на бічних пагонах першого порядку, а також більшу масу насіння. Таблиця 2 Вплив інокуляції насіння штамом R. galegae Л-13 на ріст і розвиток козлятника лікарського с. Гарант в перший та другий роки життя Варіанти Контроль (без інокуляції) Інокуляція R. galegae шт. Л-13 Контроль (без інокуляції) Інокуляція R. galegae шт. Л-13 Висота росДовжина лин, см міжвузля, см Перший рік життя 47±1,4 4,3±0,34 62±0,7 5,0±0,5 Другий рік життя 87,5±1,3 6,0±0,8 115,0±3,5 7,9±0,4 Кількість, од./рослину пагонів листків Маса, г надземна коріння 3,0±1,0 6,5±0,5 35,5±0,7 112±2,0 54±4,0 125±5,0 22,0±1.,5 38±2,4 8,5±0,9 12,7±0,7 143,0±4,0 178,8±4,5 230,0 310,0 38,0±2,0 43,3±4,4 Таблиця 3 Основні показники насіннєвої продуктивності козлятника лікарського у другий рік життя Варіанти Контроль (без інокуляції) Інокуляція R. galegae шт. Л-13 Кількість з 10 продуктивних пагонів, од. бобів насінин 935,5±23,0 1240,0±17,5 1060,0±14,0 1673,0±16,4 Таким чином, встановлено, що визначальним фактором активного росту рослин козлятника лікарського є інокуляція штамом Л-13, що позитивно впливає на розвиток кореневої системи, сприяє збільшенню урожаю надземної маси та забезпечує значний приріст високоякісного насіння. Приклад 3. В польовому досліді на базі ІСГМ УААН (грунт -дерново-підзолистий супіщаний, рН сольове - 6,5; вміст гумусу - 0,8-1,1%; азоту, що легко гідролізується- 56-57мг; P2O5 - 160-170мг і К2О - 100-110мг на 1кг ґрунту) протягом двох років вирощування Маса 1000 насінин, г Маса насіння, г/м 6,3 6,74 2 27,4±1,2 38,6±2,7 козлятника лікарського вивчали ефективність штаму Л-13 щодо даної культури. Перед посівом насіння козлятника скарифікували та інокулювали досліджуваним штамом із розрахунку 200-300 тис. бактеріальних клітин на насінину. В контрольному варіанті насіння змочували водою. Встановлено, що штам Л-13 є активним симбіонтом козлятника лікарського. За інокуляції рослин цим штамом на коренях рослин формуються чисельні бульбочки, які характеризуються високою здатністю до фіксації атмосферного азоту (таблиця 4). Таблиця 4 Вплив бактеризації козлятника лікарського штамом R. galegae Л-13 на формування кореневих бульбочок та їх активність протягом першого та другого років вирощування. Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Інокуляція R. galegae шт. Л-13 НІР05 Середня кількість бульбочок, од. на рослину 1-й рік вирощуван- 2-й рік вирощування ня 0,63 193,75 90,50 392,50 13,13 35,02 Штам Л-13 підвищує інтенсивність процесу фотосинтезу як в перший, так і другий роки вирощування козлятника лікарського, про що свідчить зростання вмісту хлорофілу а і b в листках іноку Азотфіксувальна активність, мкг N/рослину за годину 1-й рік вирощуван2-й рік вирощування ня 0,69 26,96 11,22 70,81 4,80 9,40 льованих рослин. Досліджуваний штам збільшує загальний вміст хлорофілів відносно контролю в перший рік на 78,0%, на другий рік - 35,5% (таблиця 5). 7 43516 Інокуляція рослин досліджуваним штамом сприяла зростанню продуктивності козлятника лікарського протягом двох років використання (табл. 6). Штам Л-13 забезпечив приріст урожаю сухої надземної маси рослин відносно контролю в 8 перший рік на 58,6%, на другий рік - 16,6%. В цілому зростання продуктивності культури у сумі за два роки вирощування порівняно до контролю становить 37,4%. Таблиця 5 Вміст хлорофілу в біомасі листя козлятника лікарського (перший та другий роки вирощування). Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Інокуляція R. galegae шт. Л-13 HIP05 1-й рік вирощування сума хлороХлорофіл а, Хлорофіл b, філів а і b, мг/100 г мг/100 г мг/100 г 121,26 39,02 160,28 177,59 107,72 285,31 27,85 15,07 2-й рік вирощування сума хлорофіхлорофіл а, Хлорофіл a, лів а і b, мг/100 г мг/100 г мг/100 г 143,79 41,14 184,93 204,47 46,02 250,49 14,84 6,61 Таблиця 6 Ефективність застосування штаму R, galegae Л-13 для передпосівної обробки насіння козлятника лікарського. Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Інокуляція R. galegae шт. Л-13 НІР05 Урожайність сухої надземної маси, т/га, 1-й рік вирощу2-й рік вирощуу сумі за 2 роки вання вання вирощування 4,73 4,83 9,56 7,50 5,63 13,13 0,80 0,48 Отже, штам R. galegae Л-13 є активним симбіонтом козлятника лікарського. За інокуляції культури даним штамом зростає чисельність кореневих бульбочок, їх нітрогеназна активність, що забезпечує рослини необхідним для росту та розвитку зв'язаним азотом. Це сприяє зростанню вмісту хлорофілів в листках рослин, підвищенню урожайності надземної маси, зростанню кількості та якості насіння. Література: 1. Утеуш Ю.А., Лобас М.Г. Кормові ресурси флори України. - К.: Наук, думка, 1996. - 222с. 2. Нові кормові, пряно смакові та овочеві інтродуценти в Лісостепу і Поліссі України / Рахметов Д.Б., Стаднічук Н.О., Корабльова О.А., Смілянець Н.М. та інші. - К.: Фітосоціоцентр, 2004. - 263с. Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко Приріст урожаю до контролю у сумі за 2 роки, % 37,34 3. Andronov E.E., Terefework Z., Roumiantseva M.L. et al. Symbiotic and genetic diversity of Rhizobium galegae isolates collected from the Galega orientalis gene center in the Caucasus. // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - Vol. 69, №2. - P.10671074. 4. Заболотна В. П. Особливості симбіотичної азотфіксації і продуктивність козлятнику східного: Автореф. дис. ... канд. біол. наук. - К., 2002. - 20с. 5. Определитель бактерий Берджи: В 2т.: Пер. с англ./ Под ред. Дж. Хоулта, И. Крига, П. Снита и др. - М.: Мир, 1997. - Т.1. - 432с. 6. Волкогон В.В. Методичні рекомендації по визначенню азотфіксації в ґрунті та кореневій зоні рослин ацетиленовим методом. - Чернігів, 1997. 14с. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601