Спосіб моніторингу інтенсивності запалення при гіперплазії ендометрія

Реферат: Спосіб моніторингу інтенсивності запалення при гіперплазії ендометрія включає дослідження біоптату ендометрія та визначення в ньому неспецифічних критеріїв запального процесу. Визначають наявність і ступінь експресії загального лейкоцитарного антигену CD 45 у біоптаті ендометрія по відношенню до норми, що становить 4,2±1,2 %, і при підвищенні рівня експресії CD45 до 21 % встановлюють помірну інтенсивність запального компонента при гіперплазії ендометрія. При збільшенні експресії CD45 до рівня вищого ніж 21 % встановлюють високу інтенсивність запального компонента. UA 91915 U (12) UA 91915 U UA 91915 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, а саме до способів діагностики та оцінки інтенсивності запалення при гіперплазії ендометрія, та може бути використана в лабораторній діагностиці для визначення інтенсивності та моніторингу запального процесу, асоційованого з гіперпластичними захворюваннями ендометрія. Згідно із сучасною етіопатогенетичною концепцією гіперплазії ендометрія як провідний фактор розглядається надлишкова естрогенна стимуляція на тлі недостатності прогестеронового впливу. Встановлено, що найчастіше дисбаланс гормональної регуляції, який супроводжується надлишковою проліферацією ендометрія, спостерігається при гіперпластичних процесах у яєчниках, некоректному застосуванні естрогенних препаратів, гіперплазії кори надниркових залоз, а також зміни в метаболізмі гормонів унаслідок порушень жирового та вуглеводного обміну. Однак, у багатьох випадках розвиток гіперпластичних процесів в едометрії відбувається без гіперестрогенемії. Серед можливих механізмів розвитку гіперплазій ендометрія, важливим фактором є запальний процес, який спостерігається в 4659 % хворих на гіперплазію і більш ніж у 20 % випадків є причиною її розвитку. Роль запалення в розвитку гіперпластичних процесів ендометрія підтверджується успішним досвідом використання протизапальної терапії в комплексному лікуванні гіперплазії ендометрія. Недостатня ефективність існуючих терапевтичних схем зумовлює необхідність уточнення превалюючого механізму розвитку в кожному клінічному випадку та проведення лікування з урахуванням провідного патогенетичного механізму. Розробка діагностичного підходу для виявлення наявності запального компонента в патогенезі гіперплазії ендометрія та його моніторингу дозволяє вдосконалити існуючі схеми лікування з врахуванням ролі запалення. Як прототип вибрано спосіб оцінки інтенсивності запалення при гіперплазії ендометрія (Хмельницкий O.К. Патоморфологическая диагностика гинекологических заболеваний. – Спб: Сотис, 1994. – С. 136-144; Кузнецова А.В. Хронический ендометрит //Архив патологии. – 2000. – № 3. – С. 48-52), що полягає в отриманні маткового біоптату та проведенні стандартного гістологічного дослідження, за допомогою якого оцінюють комплекс порушень мікроциркуляції, лімфо-лейкоцитарної інфільтрації, склеротичних змін, що є загальними морфологічними ознаками хронічного запалення. Ознаками, які співпадають з істотними ознаками заявленого способу, є: дослідження біоптату ендометрія та визначення в ньому неспецифічних критеріїв запального процесу. Технічним результатом корисної моделі є: можливість використання більш об'єктивного та параметричного (з можливістю кількісної оцінки інтенсивності запального компонента при гіперплазії ендометрія), висока інформативність незалежно від фази менструального циклу. Причинами, які перешкоджають досягненню очікуваного технічного результату, є: низька точність оцінки морфологічних змін і складність їх аналізу при гіперплазії ендометрія, асоційованої із хронічним запальним процесом, відсутність можливості оцінювати інтенсивність запального компонента. В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалення способу-прототипу шляхом здійснення імуногістохімічного дослідження біоптату ендометрія замість гістологічного дослідження за рахунок визначення в матковому біоптаті рівня експресії загального лейкоцитарного антигену CD 45, який є найбільш розповсюдженим глікопротеїном гематопоетичної системи та представлений на поверхні більшості клітин, які беруть участь в імунно-запальній реакції: Т і В лімфоцитів, гранулоцитів, моноцитів і макрофагів, тому його визначення здатне з високою точністю й об'єктивністю встановити наявність та інтенсивність запального компонента при гіперплазії ендометрія. Поставлена задача вирішується тим, що в способі моніторингу інтенсивності запалення при гіперплазії ендометрія, який включає дослідження біоптату ендометрія та визначення в ньому неспецифічних критеріїв запального процесу, згідно з корисною моделлю, визначають наявність і ступінь експресії загального лейкоцитарного антигену CD 45 у біоптаті ендометрія по відношенню до норми, що становить 4,2±1,2 %, і при підвищенні рівня експресії CD 45 до 21 % встановлюють помірну інтенсивність запального компонента при гіперплазії ендометрія, при збільшенні експресії CD 45 до рівня вищого ніж 21 % встановлюють високу інтенсивність запального компонента, що дозволяє здійснювати моніторинг характеру запального процесу. Між сукупністю існуючих ознак запропонованого способу й очікуваним технічним результатом, виявляється наступний причинно-наслідковий зв'язок: визначення експресії загального лейкоцитарного антигену CD 45 у біоптаті ендометрія дозволяє визначити наявність і параметрично оцінити ступінь інтенсивності запального компонента та проводити його моніторинг при гіперплазії ендометрія незалежно від фази менструального циклу. 1 UA 91915 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Спосіб полягає в наступному. Матковий біоптат отримують шляхом проведення лікувально-діагностичного вискоблювання порожнини матки. Отриману тканину фіксують у 10 % розчині нейтрального забуференого формаліну. Фіксатор відмивають у проточній воді протягом 24 годин. Тканину ендометрія обезводнювали в серії спиртів, просвітлювали в ксилолі, витримували в насиченому при +37 °C розчині парафіну в ксилолі, поміщали в парафін при +56 °C, потім – у суміш парафіну і ксилолу з подальшим виготовленням парафінових блоків. З парафінових блоків готували зрізи товщиною 4-5 мкм, фарбували гематоксиліном Мейера й еозином. Імуногістохімічне дослідження проводили за стандартними методиками і протоколами на серійних парафінових зрізах товщиною 4-5 мкм, які були розміщені на адгезивному склі, покритому полілізином ("Menzel-Glaser", Німеччина). Імуногістохімічне дослідження виконувалось за допомогою системи візуалізації EnVision™ FLEX+, High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus), Code K8024 фірмы Dako (Данія), що призначена для роботи на автостейнері (Dako Autostainer Instruments). Демаскування антигенів виконували в камері Паскаля протягом 3 хвилин з температурою, що підвищується до 115 °C з наступним поступовим зниженням. Автостейнер забезпечує стандартизацію в постановці імуногістохімічного методу дослідження та отримання препаратів високої якості для подальшої коректної діагностики. Вмонтований комп'ютер здійснює точний контроль дотримання температурного режиму, роботу таймера, індикацію в разі виникнення помилки. Програмне забезпечення передбачає проведення стандартних протоколів імуногістохімічних досліджень. Для ідентифікації клітин лімфоїдного ряду проводили імуногістохімічне дослідження з використанням мишиних моноклональних антитіл до рецепторів загального лейкоцитарного антигену CD 45 (Clone 2B11+PD7/26) відповідно до протоколу дослідження фірми Dako. Результати імуногістохімічного дослідження оцінювали з урахуванням розподілення трансмембранної експресії CD45+ імунокомпетентних клітин у стромі ендометрія. Як позитивний контроль використовували тканину мигдалин, як негативний - мозкову тканину. Підрахунок позитивних клітин проводили в 10 полях зору із розрахунку на 100 стромальних клітин при збільшенні ×200 у відсотковому еквіваленті. Морфометричне дослідження включало підрахунок клітин за допомогою програми Software DP-SOFT. Фотографування здійснювали за допомогою цифрової камери OLYMPUS C 5050Z, встановленої на мікроскопі OLYMPUS CX 41. Для підтвердження результатів, отриманих при визначенні рівнів експресії загального лейкоцитарного антигену CD 45, як діагностичні критерії запального компонента при гіперплазії ендометрія і можливості їх використання для моніторингу запалення, проведена серія клінічних досліджень з визначенням рівнів експресії CD 45 у маткових біоптатах 89 хворих жінок з різними гістологічними формами гіперплазії ендометрія. Як контроль застосовували вимірювання аналогічних показників у 18 клінічно здорових жінок. У таблиці 1 наведено дані про рівні експресії загального лейкоцитарного антигену CD 45 у біоптатах едометрія в жінок з різними формами гіперплазії ендометрія, а також засновані на зміні цього показника рівні інтенсивності запального компонента при гіперплазії ендометрія. Виражене підвищення CD 45 у біоптатах ендометрія більш ніж у 12 разів вище контролю, зафіксоване при клінічному обстеженні жінок, хворих на різні форми гіперплазії ендометрія, підтверджує можливість використання визначення експресії загального лейкоцитарного антигену CD 45 у біоптатах ендометрія як діагностичного критерію запального компонента при гіперплазії ендометрія і його моніторингу. У результаті проведених досліджень було встановлено, що лейкоцитарна інфільтрація в нормальному ендометрії, яка визначається за рівнем експресії CD 45, становить 4,2±1,2 %. При підвищенні рівня експресії CD 45 до 5 разів по відношенню до норми, тобто до 21 % встановлюють помірну інтенсивність запального компонента при гіперплазії ендометрія. При збільшенні експресії CD 45 до рівня, вищого ніж 21 % встановлюють високу інтенсивність запального компонента при гіперплазії ендометрія, що дозволяє здійснювати моніторинг характеру запального процесу. У порівнянні зі способом-прототипом заявлений спосіб моніторингу запального компонента при гіперплазії ендометрія дозволяє, використовуючи імуногістохімічний метод дослідження рівня експресії загального лейкоцитарного антигену CD 45, визначити наявність у хворої запального компонента, асоційованого з гіперплазією ендометрія, проводити моніторинг інтенсивності запалення в ендометрії, підвищити точність діагностики, обґрунтувати необхідність проведення протизапальної терапії, що може бути використане при встановленні наявності запального компонента гіперпластичних захворювань ендометрія. 60 2 UA 91915 U 5 10 15 20 25 Приклад 1 Хвора Т., вік 39 років, звернулася зі скаргами на ановуляторні маткові кровотечі, що виникають після затримки чергової менструації, кров'янисті виділення в міжменструальний період. Після проведення первинного обстеження, до якого входило і стандартне морфологічне дослідження біоптату, було встановлено діагноз комплексної гіперплазії ендометрія, призначено комбіновану гормональну терапію, яка викликала лише часткове поліпшення. Ановуляторні маткові кровотечі зберігалися, хоча знизився об'єм крововтрати. Було призначено імуногістохімічне дослідження рівня експресії загального лейкоцитарного антигену CD 45 за пропонованим способом, у результаті якого було виявлено підвищення рівня CD 45 до 42,4 %. Таким чином, було встановлено високу інтенсивність запального компонента. Завдяки застосуванню запропонованого способу терапевтична схема була своєчасно доповнена використанням протизапальних антибактеріальних, імуномодулюючих засобів фізіотерапевтичними методами лікування. Приклад 2 Хвора П., вік 34 роки, звернулася зі скаргами на овуляторні маткові кровотечі помірної інтенсивності, періодичний біль внизу живота, кров'янисті виділення в міжменструальний період. Після проведення обстеження, до якого входило імуногістохімічне дослідження рівня експресії загального лейкоцитарного антигену CD 45 у біоптаті за даним способом, який становив 16,5 %, було встановлено діагноз простої гіперплазії ендометрія з помірною інтенсивністю запального компонента. Було призначено комбіновану гормональну терапію із додаванням протизапальних та імунокоригуючих препаратів. Використання запропонованого способу дозволяє на основі об'єктивних параметричних критеріїв визначити наявність та інтенсивність запального процесу, проводити моніторинг його розвитку, скорочує час для призначення адекватної протизапальної терапії, визначає необхідну тривалість курсу терапії і прогноз, а також дозволяє об'єктивно оцінювати ефективність терапії, що проводиться. Таблиця Групи Контроль Проста ГЕ Комплексна ГЕ n CD 45 (%) 18 4,2±1,2 41 19,9±0,9* 36 31,2±2,1* Комплексна ГЕ з атипією 12 57,8±2,4* Примітка. Зірками позначено достовірність порівнянь (р