Спосіб оцінки типу мітохондріально-біоенергетичного обміну букального епітелію

Реферат: UA 92052 U UA 92052 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини і може застосовуватися в технологіях клініколабораторного моніторингу для індивідуалізації комплексного лікування пацієнтів і їх реабілітації. Як відомо, виникнення та розвиток захворювань визначається функціональним станом контактно-захисних систем організму пацієнта, системними рефлекторно-судинними реакціями, якістю та своєчасністю спеціалізованої медичної допомоги і проявляється запальними змінами у щелепнолицевій ділянці (ЩЛД), а також порушенням репаративних процесів [Михайлова Л.Н. Репаративная регенерація костной и хрящевой ткани в условиях воздействия различных биомеханических факторов: автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора мед. наук / Л.Н. Михайлова; Институт эволюционной морфологи и экологии животных им. А.Н. Северцова. - М., 1988. - 29 с.; Астахова B.C. Иммунологические аспекты современной стоматологи и челюстно - лицевой хирургии / B.C. Астахова, В.А. Маланчук, О.Л. Серенкова // Сб. тез. Республ. конф. "Современная стоматология и челюстно-лицевая хирургия". - К., 1998. С. 9-10]. При запальному процесі зростають енерготраси організму, особливо на тлі системної прозапальної відповіді, що і слугує чинником порушень клітинного енергообміну (мітохондріальної зумовленості порушень), які складають морфологічний субстрат формування перебігу запального процесу (Зеленько О.А. Вплив комбінованої дії стрес-факторів на перебіг адаптаційних реакцій організмі //Фізіол. журнал. - 2002. - Т. 48, №2. - С. 97-98.), насамперед за рахунок гіпоксії тканин та порушень окислювального фосфорилювання та зниження активності мітохондріальної транспортної системи (Коган B.C., Орлов О.Н., Прилипко Л.Л. Проблема анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов. - Μ.: Медицина, 1986. - 287 с.). Відомий спосіб діагностики мітохондріально-залежних розладів біоенергетики клітин, який включає урахування стану енергетичного обміну на рівні ферментативного аеробного та анаеробного ланцюгів мітохондріальної біоенергетики. При цьому, активність аеробних мітохондріальних ферментів: сукцинатдегідрогенази (СДГ), глутаматдегідрогенази (ГДГ) та анаеробних мітохондріальних ферментів α - гліцерофосфатдегідрогенази (α-ГФДГ) та позамітохондріальної лактатдегідрогенази (ЛДГ) визначають у лімфоцитах периферичної крові, застосовуючи кількісний цитохімічний метод Пірса у модифікації Р.П. Нарциссова (1986) и E.I. Обозної (1989) у реакції з нітрофіолетовим тетразолієм з наступною візуалізацією та морфометрією (Чевари С, Андеял Т., Штренгер Я. Определение анти-оксидантных параметров крови и их диагностическое значение // Лабораторное дело. - 1991. - № 10. - С. 9-13). Спосіб базується на здатності n-нітротетразолію фіолетового в процесі ферментативної реакції утворювати водонерозчинні гранули формазану, кількість яких підраховують у кожній з клітин. Цитохімічні реакції виконують на мазках крові, а фіксацію препарату проводять 60,0 % розчином ацетону, попередньо насиченим динатрієвою сіллю етилендіамінтетраоцетної кислоти (ЭДТА) за визначених стандартних умов цитохімічної фіксації мазків; для визначення активності ферменту в популяції лімфоцитів - підраховують кількість гранул формазану в 30 клітинах за умов мікроскопії мазків при збільшенні їх у 400 разів з подальшим перерахунком рівня ферментів в гранулах на клітину (гр/кл). Зростання ферментативної активності супроводжується збільшенням у лімфоцитах кількості гранул формазану; водночас, утворення в лімфоцитах поліморфних, великих агрегатів формазану, свідчить про пошкодження мітохондрій, насамперед - мітохондріальних мембран. Недоліками цього способу є неурахування загальної реакції окислювального гомеостазу у взаємозв'язку з типом мітохондріального енергодефіциту клітин, що знижує точність діагностики, особливо на ранніх стадіях формування запального процесу, зокрема - у пацієнтів, з захворюваннями та пошкодженнями ЩЛД. Відомий також спосіб оцінки мітохондріальної біоенергетики шляхом визначення рівня вмісту загального карнітину сироватки крові ензиматичним методом (Коган B.C., Орлов О.Н., Прилипко Л.Л. Проблема анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов. - М.: Медицина, 1986. - 287 с.). Спосіб базується на здатності вільного карнітину ацитилюватися при взаємодії з ацетил-КоА у присутності карнітил-ацетил-трансферази; коензим А, що утворюється в результаті реакції, взаємодіючи з 5,5'-дитиобіс-2-тетрабензойною кислотою, утворює забарвлений продукт, а кількість цього продукту пропорційно вмісту вільного карнітину; визначається спектрофотометрично при λ=412 нм, а отриманий результат перераховується в мкмоль/л сироватки крові. Недоліком цього способу також є неурахування загальної реакції окислювального гомеостазу у взаємозв'язку з типом мітохондріального енергодефіциту клітин, що знижує точність діагностики. 1 UA 92052 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відомий спосіб діагностики реакцій окислювального гомеостазу за показниками окисної модифікації білків, нуклеїнових кислот та рівнями вмісту первинних і вторинних продуктів перекисного окислення ліпідів мембран клітин (Черкашина Л.В. Мета-аналіз функціонального стану окислювального гомеостазу під впливом антиоксидантої терапії хворих з системними дерматозами // Медицина - 2008. - № 3. - С. 45-50). Цей спосіб дозволяє диференціювати наявність у пацієнта однієї із реакцій окислювального гомеостазу: функціональної компенсації, дисбалансу чи метаболічної компенсації. Для його здійснення виконують біохімічне дослідження периферичної крові пацієнта, визначаючи стан ферментативного ланцюга окислювального гомеостазу за вмістом супероксиддисмутази, глу-татіонпероксидази, каталази у еритроцитах та α-токоферолу ацетату у сироватці крові. Окрім цього визначають вміст продуктів перекисного окислення ліпідів: малонового діальдегіду та дієнових кон'югатів і вміст NO-залежних метаболітів в плазмі, а також вміст білкових компонентів у сироватці крові 2,4 динітрофенілгідрозонів та альдегідних і карбонільних продуктів окисної модифікації білків у спонтанних та індукованих біохімічних реакціях. Після цього, застосовуючи спеціальний табличний алгоритм, виконують диференційну діагностику реакцій окислювального гомеостазу. Недоліком цього способу є його громіздкість та ресурсозатратність, а також недоврахування типу мітохондріального енергодефіциту клітин, що знижує точність діагностики та збільшує терміни її виконання. Відомий також спосіб експрес-оцінки рівня соматичного здоров'я (Пат. 7296, Україна), який включає дослідження показників енергетичного потенціалу, який відрізняється тим, що проводять визначення показника електронегативності ядер (ЕНЯ %) букального епітелію, одержані значення порівнюють із значеннями центильних шкал оцінки біофізичних характеристик букального епітелію, при визначенні показника ЕНЯ % в межах 25-75 центилів встановлюють категорію "здоров'я", при визначенні показника ЕНЯ % в межах 10-25 та 75-90 центилів встановлюють категорію "передхвороба", а при визначенні показника ЕНЯ% в межах 0-10 та 90-100 центилів встановлюють категорію "хвороба". Однак виконання цього способу потребує формування спеціальних вентильних шкал, що унеможливлює його застосування у людей різного віку [Шахбазов В.Г., Колупаева Т.В., Набоков А.Л. Новый метод определения биологического возраста человека // Лаб. Дело. - Μ.: Медицина, 1986. - № 7. - С. 404-407]. Спосіб (Пат. 17358, Україна) експрес-тестування тяжкості стану хворих з нейродегенеративними захворюваннями шляхом дослідження показників електричного потенціалу, який відрізняється тим, що у хворих беруть пробу клітин букального епітелію, проводять їх мікроелектрофорез, визначають кількість клітин з електронегативними ядрами, розраховують їх відсоток до вікової норми і при його зниженні до 30 % визначають середній ступінь тяжкості хворих, при зниженні на 30 % і більше - тяжкий стан. Цей спосіб є найбільш близьким по технічній суті та результату, що може бути досягнуто, тому його вибрано за найближчий аналог. В основу корисної моделі поставлена задача зменшення ресурсозатратності та підвищення точності діагностики мітохондріальної біоенергетики шляхом динамічної оцінки мітохондріальнобіоенергетичного обміну в клітинах букального епітелію. Поставлена задача вирішується тим, що у способі оцінки типу мітохондріальнобіоенергетичного обміну букального епітелію, який включає забір проб клітин букального епітелію та їх мікроелектрофорез, згідно з корисною моделлю, попередньо виконують вимір питомої ваги електронегативних ядер букального епітелію у електрофоретичному середовищі (λ, с), а стан мітохондріально-біоенергетичного обміну оцінюють за показником абілітації (ІА), який розраховують за формулою ІА= λ1/λ2, де λ1 - питома вага ЕНЯ букального епітелію на попередньому, λ2 - на наступному етапах лікування чи реабілітації; і коли ІА≤1,0 міхохондріально-біоенергетичний обмін оцінюють як де-задаптивний, і навпаки. Зменшення ресурсозатратності та підвищення точності діагностики мітохондріальної біоенергетики шляхом оцінки мітохондріально-біоенергетичного обміну в клітинах букального епітелію при пошкодженнях та захворюваннях ШЛД досягають тим, що для процедури діагностики застосовують найбільш інформативний показник - індекс абілітації. Спосіб виконують наступним чином. У обстежуваного пацієнта на етапах лікування чи реабілітації тупим шпателем беруть пробу клітин букального епітелію. Далі клітини у нативному стані (їх не фіксують і не фарбують) переносять в електрофоретичну камеру і досліджують під мікроскопом при збільшенні х400. Камеру підключають до приладу для мікроелектрофорезу. На електроди камери подають напругу 30В, струм в камері - 100мкА. В кожному препараті досліджують не менш як 100 клітин і визначають питому вагу ЕНЯ букального епітелію на першому етапі (λ1) та на наступному етапі (λ2), а стан мітохондріально-біоенергетичного обміну оцінюють за показником абілітації (ІА), який розраховують за формулою ІА= λ1/λ2; і коли ІА≤1,0 2 UA 92052 U 5 10 15 міхохондріально-біоенергетичний обмін оцінюють як дезадаптивний, і навпаки. Повторність процедури забору букального епітелію дозволяє забезпечити динамічний контроль за станом мітохондріально-біоенергетичного обміну та, тим самим, оцінювати ефективність лікувальнореабілітаційних заходів. Приклад, який ілюструє спосіб. Сергій М., 1980 р.н., знаходився на стаціонарному лікуванні у відділенні щелепно-лицевої хірургії в зв'язку з травмою щелепно-лицевої ділянки, зокрема наявності травматичного перелому нижньої щелепи в ділянці суглобового відростка нижньої щелепи справа та ментального отвору зліва. На момент госпіталізації та при виписці зі стаціонару для продовження лікування та реабілітації в амбулаторних умовах, у пацієнта була взята проба букального епітелію для виміру електрофоретичної рухливості його ядер. Питома вага електронегативних ядер букального епітелію у електрофоретичному середовищі на першому етапі (λ1) склала 59 %, а на наступному етапі (λ2) - 54 %. Оскільки на етапах лікування пацієнта питома вага електронегативних ядер в пробах букального епітелію змінилась з 59 % до 54 %, то, згідно з корисною моделлю ІА>1,0, а мітохондріально-біоенергетичний обмін букального епітелію Сергія М. оцінено як адаптивний. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб оцінки типу мітохондріально-біоенергетичного обміну букального епітелію, що включає забір проб клітин букального епітелію та їх мікроелектрофорез, який відрізняється тим, що попередньо виконують вимір питомої ваги електронегативних ядер букального епітелію у електрофоретичному середовищі (λ, с), а стан мітохондріально - біоенергетичного обміну оцінюють за показником абілітації (ІА), який розраховують за формулою ІА= λ1/λ2, де λ1 - питома вага електронегативних ядер букального епітелію на попередньому, λ2 - на наступному етапах лікування чи реабілітації; і коли ІА≤1,0 мітохондріально - біоенергетичний обмін оцінюють як дезадаптивний, і навпаки. Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3