Спосіб діагностики мітохондріально-залежних реакцій окислювального гомеостазу при пошкодженнях лицевого черепа

1. Спосіб діагностики мітохондріальнозалежних реакцій окислювального гомеостазу при пошкодженнях лицевого черепа, що включає вимір рівня вмісту у плазмі крові первинних та вторинних продуктів окисної модифікації ліпідних, білкових компонентів мембран клітин та визначення вмісту ферментів антиоксидантного захисту в спонтанних і індукованих реакціях з діагностикою реакції функціональної компенсації, метаболічного дисбалансу чи метаболічної декомпенсації, який відрізняється тим, що попередньо у лімфоцитах периферичної крові пацієнтів визначають вміст лактатдегідрогенази та рівень загального карнітину у сироватці крові до початку лікування та повторно через 2-3 доби, і коли показник гістохімічної активності лактатдегідрогенази лімфоцитів пере U 2 (19) 1 3 них процесів [Михайлова Л.Н. Репаративная регенерація костной и хрящевой ткани в условиях воздействия различных биомеханических факторов: автореферат диссертации на соискание учѐной степени доктора мед. наук / Л.Н. Михайлова; Институт эволюционной морфологи и экологии животных им. А.Н. Северцова.-М., 1988.- 29 с; Астахова B.C. Иммунологические аспекты современной стоматологи и челюсно-лицевой хирургии / B.C. Астахова, В.А.Маланчук, О.Л.Серенкова // Сб. тез. Рес-публ. конф. «Современная стоматология и челюстно-лицевая хирургия».-Киев, 1998.-С.9-10]. При запальному процесі зростають енерготраси організму, особливо на тлі системної прозапальної відповіді, що і слугує чинником порушень клітинного ене-ргообміну (мітохондріальної зумовленості порушень), які складають морфологічний субстрат формування ускладненого перебігу запального процесу [Зеленько О.А. Вплив комбінованої дії стрес-факторів на перебіг адаптаційних реакцій організмі //Фізіол. журнал. - 2002. - Т. 48, №2. С.97-98.], насамперед за рахунок гіпоксії тканин та порушень окислювального фосфорилювання та зниження активності мітохондріальної транспортної системи [Коган B.C., Орлов О.Н., Прилипко Л.Л. Проблема анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов. - М.: Медицина, 1986. - 287с]. Окрім того, в патогенезі ускладненого перебігу пошкоджень лицевого черепа, як і при інших запальних процесах, діагностично цінним та прогностично значимим є активація цитокінового каскада, пошкодження ендотеліоцитів, гіпоксія тканин, «мікроциркуляторно-мітохондріальний дистрес-синдром». Відомий спосіб діагностики мітохондріальнозалежних розладів біоенергетики клітин, який включає урахування стану енергетичного обміну на рівні ферментативного аеробного та анаеробного ланцюгів мітохондріальної біоенергетики. При цьому, активність аеробних мітохондріальних ферментів: сукцинатдегідрогенази (СДГ), глутаматдегідрогенази (ГДГ) та анаеробних мітохондріальних ферментів - глицерофосфатдегідрогенази (ГФДГ) та позамітохондріальної лактатдегідрогенази (ЛДГ) визначають у лімфоцитах периферичної крові, застосовуючи кількісний цитохімічний метод Пірса у модифікації Р.П. Нарциссова (1986) и Э.И. Обозной (1989) у реакції с нітрофіолетовим тетразолієм з наступною візуалізацією та морфометрією [Чевари С, Андеял Т., Штренгер Я. Определение антиоксидантных параметров крови и их диагностическое значение // Лабораторное дело. - 1991. №10. - С.9-13]. Спосіб базується на здатності nнітротетразолія фіолетового в процесі ферментативної реакції утворювати водонерозчинні гранули формазана, кількість яких підраховують у кожній з клітин. Цитохімічні реакції виконують на мазках крові, а фіксацію препарата проводять 60,0% розчином ацетону, попередньо насиченому дінатрієвою сіллю етилендіамінтетраоцетної кислоти (ЕДТА) за визначених стандартних умов цитохімічної фіксації мазків; для визначення активності фермента в популяції лімфоцитів - підраховують кількість гранул формазана в 30 клітинах за умов мікроскопії мазків при збільшенні їх у 400 разів з подаль 57175 4 шим перерахунком рівня ферментів в гранулах на клітину (гр/кл). Зростання ферментативної активності супроводжується збільшенням у лімфоцитах кількості гранул формазана; водночас, утворення в лімфоцитах поліморфних, великих агрегатів формазана, свідчить про пошкодження мітохондрій, насамперед - мітокондріальних мембран. Недоліками цього способу є не урахування загальної реакції окислювального гомеостазу у взаємозв'язку з типом мітохондріального енергодефіциту клітин, що знижує точність діагностики, особливо на ранніх стадіях формування запального процесу, зокрема - у пацієнтів з пошкодженням лицевого черепа. Відомий також спосіб оцінки мітохондріальної біоенергетики шляхом визначення рівня вмісту загального карнитіну сироватки крові ензиматичним методом [Коган B.C., Орлов О.Н., Прилипко Л.Л. Проблема анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов. - М.: Медицина, 1986. - 287с]. Спосіб базується на здатності вільного карнітину ацитилюватися при взаємодії з ацетил-КоА у присутності карнітил-ацетилтрансферази; коэнзим А, що утворюється в результаті реакції, взаємодіючи з 5,5'-дитиобис-2тетробензойною кислотою, утворює забарвлений продукт, а кількість цього продукту пропорційно вмісту вільного карнітина; визначається спектрофотометрично при =412нм, а отриманий результат перераховується в мкмоль/л сироватки крові. Недоліком цього способу, також, є неурахування загальної реакції окислювального гомеостазу у взаємозв'язку з типом мітохондріального енергодефіциту клітин, що знижує точність діагностики, що є значимим для пацієнтів з пошкодженням лицевого черепа, особливо на ранніх стадіях формування запального процесу. Відомий спосіб діагностики реакцій окислювального гомеостазу за показниками окисної модифікацій білків, нуклеїнових кислот та рівнями вмісту первинних і вторинних продуктів перекисного окислення ліпідів мембран клітин [Шкляр СП., Фролова Т.В., Черкащина Л.В. Діагностика адаптаційних реакцій системи антиоксидантного захисту // Методичні рекомендації МОЗ України.-Київ, 2007.-20 с; Черкащина Л.В. Мета-аналіз функціонального стану окислювального гомеостазу під впливом антиоксидантої терапії хворих з системними дерматозами // Медицина І...-2008.-№3.С.45-50]. Цей спосіб дозволяє диференціювати наявність у пацієнта однієї із реакцій окислювального гомеостазу: функціональної компенсації, дисбалансу чи метаболічної компенсації. Для його здійснення виконують біохімічне дослідження периферичної крові пацієнта, визначаючи стан ферментативного ланцюга окислювального гомеостазу за вмістом супероксиддесмутази, глутатіонпероксидачи, каталази у еритроцитах та а-токоферолу ацетату у сироватці крові. Окрім того, визначають вміст продуктів перекисного окислення ліпідів: малонового діальдегіду та дієнових кон'югатів і вміст NO-залежних метаболітів в плазмі, а також вміст білкових компонентів у сироватці крові 2,4 - динітрофенілгідрозонів та альдегідних і 5 карбонільних продуктів окисної модифікації білків у спонтанних та індукованих біохімічних реакціях. Після чого, застосовуючи спеціальний табличний алгоритм, виконують диференційну діагностику реакцій окислювального гомеостазу. Недоліком цього способу є його громіздкість та ресурсозатратність, а також недоврахування типу мітохондріального енергодефіциту клітин, що знижує точність діагностики та збільшує терміни її виконання. Цей спосіб є найбільш близьким по технічній суті та результату, що може бути досягнуто, тому його обрано за найближчий аналог. В основу корисної моделі покладено задачу удосконалення способу оцінки реакцій окислювального гомеостазу у пацієнтів з пошкодженнями лицевого черепа, в якому за рахунок урахування цитохімічної активності індикативних мітохондріальних ферментів у лейкоцитах периферичної крові та біохімічних маркерів енергодефіцитності окислювального гомеостазу у сироватці крові, досягається зменшення ресурсозатратності та підвищення точності діагностики. Задача, яку покладено в основу корисної моделі, вирішується тим, що у відомому способі оцінки реакцій окислювального гомеостазу, що включає вимір рівня вмісту у плазмі крові первинних та вторинних продуктів окисної модифікації ліпідних, білкових компонентів мембран клітин та визначення вмісту ферментів антиоксидантного захисту в спонтанних і індукованих реакціях з діагностикою реакції функціональної компенсації, метаболічного дисбалансу чи метаболічної декомпенсації, згідно з корисною моделлю, попередньо у лімфоцитах периферичної крові пацієнтів визначають вміст лактатдегідрогенази та рівень загального карнітіну у сироватці крові до початку лікування та повторно через 2-3 доби, і коли показник гістохімічної активності лактатдегідрогенази лімфоцитів перевищує, а загального карнитіну менше попереднього рівня, роблять висновок про мітохондріально - енергодефіцитний варіант реакції окислювального гомеостазу у пацієнта з травматичним пошкодженням лицевого черепа, і навпаки. Можливо також у лімфоцитах периферичної крові замість лактатдегідрогенази визначати гістохімічну активність сукцинатдегідрогеназм. Також у лімфоцитах периферичної крові замість лактатдегідрогенази визначають гістохімічну активність глуїаматдегідрогенази. У лімфоцитах периферичної крові замість лактатдегідрогенази визначають гістохімічну активність гліцерофосфатдегідрогенази. Зменшеним ресурсозатратності та підвищення точності діагностики мітохондріально-залежних реакцій окислювального гомеостазу при ПЛЧ досягають тим, що для процедури діагностики застосовують найбільш інформативні показники, що дозволяє у більш короткі терміни визначати енергодефіцитні варіанти реакцій окислювального 57175 6 гомеостазу та, відповідним чином, індивідуалізувати лікувальну тактику. Спосіб виконують наступним чином. В умовах спеціалізованого стаціонару для пацієнтів з ПЛЧ із плечової вени забирають необхідну кількість крові для проведення біохімічного та гістохімічного її дослідження, після чого у лімфоцитах визначають вміст лактатдегідрогенази, а у плазмі крові - рівень вмісту загального карнітіну, і коли показник гістохімічної активності лактатдегідрогенази перевищує, а загального карнитіну менше референтного рівня, роблять висновок про мітохондріально енерго дефіцитний варіант реакції окислювального гомеостазу у пацієнта з травматичним пошкодженням лицевого черепа, і навпаки. При цьому, у разі відсутності референтної бази по цим показникам, за референтні приймають значення, отримані при первинному клініко-біохімічному обстеженні пацієнта, а визначення гістохімічної активності лактатдегідрогенази лімфоцитів та вміст загального карнитіну виконують на момент звернення пацієнта та на етапах його хірургічного лікування. Це дозволяє забезпечувати клініко-біохімічний моніторинг стану пацієнта з ПЛЧ. Приклад, який ілюструє спосіб. Пацієнт Юрій К., 37 років, звернувся 26.05.2010 р. в зв'язку з травмою лицевого черепа, зокрема наявності травматичного перелому нижньої щелепи в ділянці суглобового відростка нижньої щелепи справа та ментального отвору зліва, що отриманий напередодні. З метою діагностики мітохондріальнозалежних реакцій окислювального гомеостазу, пацієнту виконано біохімічне дослідження щодо визначення рівня вмісту загального карнитіну у сироватці крові (становить 36,5мкмоль/л) та гістохімічне дослідження змісту лактатдегівдрогенази у лейкоцитах (становить 8,4 гр/кл). Після надання медичної допомоги (хірургічне втручання по репозиції кісток черепа та комплексного лікування згідно до клінічного протоколу), 30.05.2010 р. повторно виконано біохімічне дослідження щодо визначення рівня вмісту загального карнитіну у сироватці крові (становить 22,8мкмоль/л) та гістохімічне дослідження вмісту лактатдегівдрогенази у лейкоцитах (становить 12,3гр/кл). Оскільки на етапах лікування пацієнта рівень вмісту карнитіну зменшився (з 36,5 до 22,8мкмоль/л), а вміст лактатдегідрогенази у лейкоцитах зріс (з 8,4 до 12,3гр./кл) то, згідно з корисною моделлю, можна зробити висновок про наявність у пацієнта з ПЛЧ мітохондріально-енергодефіцитного варіанту реакції окислювального гомеостазу, що сформувалась впродовж перших трьох діб з моменту травми. Таким чином, запропонований спосіб діагностики мітохондріально-залежних реакцій окислювального гомеостазу при пошкодженнях лицевого черепа дозволяє у більш короткі терміни визначати енергодефіцитні варіанти реакцій окислювального гомеостазу та, відповідним чином, індивідуалізувати лікувальну тактику. 7 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 57175 8 Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601