Спосіб агробактеріальної трансформації рослин in planta
Номер патенту: 92437
Опубліковано: 11.08.2014
Автори: Чеканова Ольга Юріївна, Парій Мирослав Федорович, Парій Ярослав Федорович, Кірієнко Сергій Олександрович, Богульська Світлана Валеріївна, Парій Федір Микитович
Формула / Реферат
Спосіб агробактеріальної трансформації рослини in planta, що включає запилення рослин та обробіток агробактеріальною суспензією, який відрізняється тим, що для синхронізації процесу запліднення з процесом інтеграції Т-ДНК використовують стерильну форму, яку запилюють пилком фертильних рослин.
Текст
Реферат: Спосіб агробактеріальної трансформації рослини in planta включає запилення рослин та обробіток агробактеріальною суспензією. При цьому для синхронізації процесу запліднення з процесом інтеграції Т-ДНК використовують стерильну форму, яку запилюють пилком фертильних рослин. UA 92437 U (54) СПОСІБ АГРОБАКТЕРІАЛЬНОЇ ТРАНСФОРМАЦІЇ РОСЛИН IN PLANTA UA 92437 U UA 92437 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі сільського господарства та біотехнології, і може застосовуватися в селекції рослин при створені нових сортів і гібридів за допомогою генетичної інженерії для підвищення продуктивності сільськогосподарських культур. Відомий спосіб генетичної трансформації рослин - це прямий ввід генів, який був розроблений у 1988 році (T. Klein, J. Sanford et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 4305-4309, 1988), автори назвали цей спосіб "біологічною балістикою" (biolistic). Спосіб полягає у наступному: на золоті чи вольфрамові частинки розміром в десяті долі мікрона наносять ДНК, які містять генні конструкції. В спеціальному пристрої частинки з нанесеною на них ДНК розганяють у вакуумі до швидкості, достатньої для проникнення в клітини-мішені здатних до регенерації рослин in vitro. Після такого "обстрілу" необхідно виділити на селективних середовищах трансформовані клітини і отримати з них рослини-регенеранти. Недоліком даного способу є складний довготривалий процес отримання трансформантів та низька частота трансформації. Також розробники (напр., Pioneer Hi-Bred International, пат. US 6229078) констатують, що деякі рослини майже не можливо трансформувати біобалістичним методом. Відомий спосіб отримання трансгенних рослин був здійснений в 1990 році, в ньому використовувалася методика агробактеріального переносу генів в апікальну меристему проростків [В. Schrammeijer et al., Plant Cell Report, 9: 55-60, 1990]. Недоліком цього способу є низька ефективність трансформації, яка складала всього соті долі відсотків. Відомий спосіб отримання трансгенних рослин соняшника, що включає обробіток клітин меристематичної тканини соняшника, здатної до регенерації цілих рослин, бомбардуванням їх мікрочастинками твердої речовини, трансформацію даних клітин сокультивуванням з агробактерією, яка містить вектор, що несе корисний або маркерний гени, а також ген стійкості до антибіотика чи гербіциду. Відбір трансформованих клітин і регенерацію із них цілих рослин проводили, використовуючи індукцію апікальних меристем, здатних регенерувати в цілу рослину [Гапоненко А.К. Способ получения трансгенных растений подсолнечника (патент РФ № 2179187), 2002]. Недоліком даного способу є використання спеціального обладнання та довготривалий процес отримання трансформантів. Також при використанні культури тканин in vitro можливі сомаклональні мінливості. Найближчим аналогом є спосіб трансформації in planta A. Thaliana шляхом занурення квіткових бруньок в суспензію A. tumefaciens. Для трансформації використовують зелені і незрілі квіткові бруньки. Інокуляцію проводять шляхом занурення квіткових бруньок в бактеріальну суспензію при легкому струшуванні для полегшення проникнення бактерій в бруньки. Час інокуляції складає від 1 до 2 хвилин при трьох концентраціях Silwet L-77: 300, 400 і 500 мкл/л. Після інокуляції рослини витримують в умовах підвищеної вологості протягом 24 годин, а потім вирощують в умовах довгого дня до отримання насіння [Викторэк-Смагур А., Хнатушко-Конка К., Кононович А.К. Сравнение двух методов трансформации Arabidopsis thaliana: погружение цветочных почек и вакуумная инфильтрация // Физиология растений. 2009. - Т. 56, № 4. - С. 619-628]. Найближчий аналог та корисна модель, що заявляється, мають наступні спільні ознаки: трансформація in planta з використанням суспензії А. tumefaciens для інокуляції квітів. Недоліком найближчого аналога є випадкова інтеграція Т-ДНК в різні тканинні клітини за рахунок невизначеності клітини-мішені та потреба у спеціальному лабораторному обладнані. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб агробактеріальної трансформації рослин, шляхом запилення рослин та обробітку агробактеріальною суспензією, для синхронізації процесу запліднення з процесом інтеграції Т-ДНК використовують стерильну форму, яку запилюють пилком фертильних рослин. Поставлена задача вирішується тим, що використовують стерильні рослини, які запилюють пилком фертильних рослин та обробляють бактеріальною суспензією. Після запилення стерильних квітів та проростання пилкової трубки (для кожної культури цей час індивідуальний), їх обробляють агробактеріальною суспензією. Це синхронізує процеси запліднення та інтеграції Т-ДНК. Новими ознаками корисної моделі є використання стерильних форм рослин з двостатевими квітами та синхронізація процесу запліднення з інтеграцією Т-ДНК. Інтеграція Т-ДНК в геном рослин при використанні процесу запилення-запліднення відбувається в період від проростання пилкової трубки до злиття двох гамет [Luo Z.-X., Wu R. A simple method for the transformation of rice via the pollentube pathway // Molecular Biology Reporter. - 1989. - Vol. 7. - P. 69-77. Чесноков Ю.В., Наследственные изменения, вызванные переносом 1 UA 92437 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 экзогенной ДНК в высшие растения посредством проростающей пыльцы. Докт. Дис. СПб, 2000.]. В зв'язку з цим необхідно синхронізувати цвітіння квітів, їх запилення і обробку бактеріальною суспензією. У культур, які мають двостатеві квіти, наприклад соняшник, буряк, ріпак та ін., запилення та запліднення фертильних форм в часі не можливо контролювати. Одні квіти вже запилилися, а інші ще не розкрилися і, в зв'язку з цим, проведена інокуляція бактеріальними клітинами охоплює малу кількість квіток, вибраних як мішені для трансформації. Використання ручної кастрації у цих рослин процес трудомісткий та довготривалий. У стерильних форм можливо контролювати процес запилення-запліднення шляхом ізоляції їх і послідуючого запилення. Тому для агробактеріальної трансформації рослин з двостатевими квітами необхідно використати стерильні форми і проводити їх запилення, це дасть можливість синхронізувати процес запліднення і вбудування Т-ДНК в геном рослин. Спосіб здійснюється в наступному порядку. Квіти стерильних рослин ізолюють пергаментними або бязевими ізоляторами до початку цвітіння. Після розкриття найбільш можливої кількості квіток на приймочки наносять пилок того ж сорту, гібриду чи лінії, проводять обробіток суспензією бактеріальних клітин. Для інокуляції квітів використовують суспензію клітин з Agrobacterium tumefaciens. З даних рослин збирають насіння та відбирають стійкі рослини. Спосіб, що заявляється, був здійснений у польових умовах. Для трансформації використали стерильні рослини, донорами пилку були рослини цих же сортів та гібридів. Вектором для перенесення гену стійкості слугувала Agrobacterium tumefaciens штам LBA4404 з плазмідою, яка несе bar-ген, що визначає стійкість до гербіциду Баста із діючою речовиною фосфінотріцин. Плазміда містила селективні гени стійкості до антибіотиків та поставлена під промотер 35S CaMV вірусу мозаїки цвітної капусти. Агробактерії культивували протягом 24-48 годин в рідкому середовищі LB (Луріа Бертрані - рідке живильне середовище для вирощування бактеріальних культур. Містить гідролізат казеїну, бактодріжджовий екстракт і NaCl) з додаванням антибіотиків (50 мг/л канаміцину, 50 мг/л рифампіцину та 25 мг/л гентоміцину) на качалці (150-200 об/хв) при температурі 28 °C. Перед трансформацією до суспензії бактеріальних клітин додавали 0,5 % сахарозу та поверхнево-активну речовину Silwet L-77. Silwet L-77 - це хімічна суміш гептаметилтрисилоксану, модифікованого поліалкіленоксидом (84 %), і метилового ефіру алілоксиполіетиленгліколю (16 %), яка випускається "OSi Specialties Inc". До початку цвітіння квіти стерильної та фертильної форми ріпаку ізолювали пергаментними ізоляторами. Після розкриття квітів стерильної форми їх запилювали пилком фертильних форм того ж гібриду. Після проростання пилкової трубки у ріпаку, цей час становить 20-30 хвилин, проводили інокуляцію протягом 1 хв. шляхом занурення суцвіть ріпаку у бактеріальну суспензію. Витримували в умовах підвищеної вологості 24 години та залишали під пергаментними ізоляторами до отримання насіння (таб. 2). Обробіток бактеріальною суспензією квітів фертильної форми проведений так само, як і стерильних. Обробляли цілі суцвіття без вибірки квітів (таб. 1). Суцвіття буряка стерильної і фертильної форми ізолювали пергаментними ізоляторами до початку цвітіння. Стерильні форми запилювали пилком фертильних форм того ж гібриду. Після проростання пилкової трубки, у буряка це 30-60 хвилин, проводили інокуляцію протягом 1 хв. шляхом занурення суцвіть буряка у бактеріальну суспензію. Витримували в умовах підвищеної вологості 24 години та залишали під пергаментними ізоляторами до отримання насіння (таб. 2). Обробіток бактеріальною суспензією квітів фертильної форми проведений так само, як і стерильних. Обробляли цілі суцвіття без вибірки квітів (таб. 1). Кошики соняшника стерильних і фертильних форм ізолювали бязевими ізоляторами до початку цвітіння. Стерильні форми запилювали пилком фертильних форм тієї ж лінії. Після проростання пилкової трубки, у соняшника цей час становить 1,5-2 години від запилення, обрізали приймочки та наносили A. tumefaciens шляхом занурення кошика в бактеріальну суспензію протягом 1 хв. Витримували 24 години в умовах підвищеної вологості та залишали кошики під бязевими ізоляторами до отримання насіння (таб. 2). Обробіток бактеріальною суспензією квітів фертильної форми проведений так само, як і стерильних, але обробляли усі квіти у кошику без вибірки (таб. 1). Згідно з запропонованим способом використання стерильних рослин в період активного цвітіння, їх запилення і обробіток бактеріальною суспензією дозволить синхронізувати процес запліднення і вбудування Т-ДНК в геном рослин, що забезпечує збільшення рівня трансформації. 2 UA 92437 U Таблиця 1 Частота вбудування Т-ДНК в геном фертильних форм рослин після обробки їх A. Tumefaciens Культура Ріпак Буряк Соняшник Вибірка зерен Кількість сходів шт 1300 1300 1300 шт 1269 1273 1285 Кількість стійких рослин, (після обробки гербіцидом) шт 9 8 6 Кількість стійких рослин до загальної к-ті зерен % 0,7 0,6 0,5 Таблиця 2 Частота вбудування Т-ДНК в геном стерильних форм рослин після обробки їх A. Tumefaciens, згідно із запропонованим методом Культура Ріпак Буряк Соняшник Вибірка зерен Кількість сходів шт 1300 1300 1300 шт 1275 1283 1279 Кількість стійких рослин, (після обробки гербіцидом) шт 37 41 33 Кількість стійких рослин до загальної к-ті зерен % 2,8 3,1 2,5 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб агробактеріальної трансформації рослини in planta, що включає запилення рослин та обробіток агробактеріальною суспензією, який відрізняється тим, що для синхронізації процесу запліднення з процесом інтеграції Т-ДНК використовують стерильну форму, яку запилюють пилком фертильних рослин. 10 Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3
ДивитисяДодаткова інформація
Автори англійськоюKirienko Serhii Oleksandrovych, Parii Myroslav Fedorovych, Parii Yaroslav Fedorovich, Parii Fedir Mykytovych
Автори російськоюКириенко Сергей Александрович, Парий Мирослав Федорович, Парий Ярослав Федорович, Парий Федор Никитич
МПК / Мітки
МПК: A01H 1/04
Мітки: трансформації, спосіб, агробактеріальної, planta, рослин
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/5-92437-sposib-agrobakterialno-transformaci-roslin-in-planta.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб агробактеріальної трансформації рослин in planta</a>
Попередній патент: Багатовиткова кругова індукційна індукторна система для магнітно-імпульсного притягання тонкостінних листових металів
Наступний патент: Спосіб виготовлення радіаційно-безпечних шлаколужних в’яжучих на основі відвальних доменних шлаків і лужних компонентів
Випадковий патент: Спосіб утилізації відхідних агломераційних газів