Спосіб застосування agrobacterium-опосередкованої трансформації in planta для отримання трансгенних рослин соняшника (helianthus annuus l.)

Реферат: Спосіб застосування Agrobacterium - опосередкованої трансформації in planta, для отримання трансгенних рослин соняшника (Helianthus annuus L.) включає перенесення цільового трансгена в геном соняшника. Процесу трансформації піддають вегетуючі in vivo рослини, у яких на приймочку маточки трубчатих квітів в період запилення наносять суспензію агробактеріальних клітин, розведену у спеціальних середовищах для інокуляції (середовище І, II). UA 86108 U (54) СПОСІБ ЗАСТОСУВАННЯ AGROBACTERIUM-ОПОСЕРЕДКОВАНОЇ ТРАНСФОРМАЦІЇ IN PLANTA ДЛЯ ОТРИМАННЯ ТРАНСГЕННИХ РОСЛИН СОНЯШНИКА (HELIANTHUS ANNUUS L.) UA 86108 U UA 86108 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнології, генетичної інженерії, сільського господарства. Може бути використана для гарантованого отримання трансгенних фертильних рослин та подальшого створення ліній соняшника з новими властивостями. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення методу генетичної трансформації з використанням обеззброєних штамів Agrobacterium tumefaciens для інтеграції трансгенів у геном соняшника, та прискореного економічно вигідного способу отримання біотехнологічних рослин з цільовими генами. Значна увага приділяється генетичному удосконаленню ліній і сортів соняшника Н. annuus біотехнологічними методами. Особливий інтерес викликає Agrobacterium - опосередкована трансформація, яка у порівнянні з іншими способами має ряд значних переваг. Однак, одне із головних обмежень цієї молекулярної біотехнології по генетичному поліпшенню багатьох комерційних ліній соняшника пов'язане із системою культивування in vitro. Виникнення химер, передчасне цвітіння in vitro та незадовільне укорінення регенерантів суттєво обмежує отримання трансгенних форм, придатних для подальшої селекційної роботи. Тому доцільною є розробка прийомів та способів генетичної трансформації, які дозволяють обійти процедури культивування in vitro. До їх числа належить Agrobacterium - опосередкована трансформація in planta, при якій генетичній трансформації піддаються клітини генеративних тканин, здатних до утворення гамет (такий підхід не застосовувався в біотехнології соняшника). Ефективність інтеграції Т-ДНК в геном однодольних рослин в процесі запилення показана Чумаковим М.І. і співав. [1, 2]. З використанням даного методу нами раніше були отримані інбредні лінії кукурудзи, що містять дволанцюговий РНК - супресор (длРНК - супресор) гена проліндерідрогенази та їх насіннєве покоління [3]. В основу корисної моделі поставлена задача створення прискореного та гарантованого методу отримання трансгенних рослин соняшника з використанням Agrobacterium опосередкованої трансформації in planta. Суть корисної моделі полягає у Agrobacterium - опосередкованій трансформації in planta соняшника: суспензія клітин агробактерії наноситься на приймочки маточок трубчатих квітів в період запилення. При цьому використовуються інокуляційні середовища, ефективні для інтеграції рекомбінантних молекул ДНК у геном рослин інбредних ліній соняшника, що забезпечує отримання життєздатного насіння та добір генотипів, у насіннєвому поколінні яких наявні цільові гени. Приклад реалізації корисної моделі. При розробці способу Agrobacterium - опосередкованої трансформації in planta використовували інбредні лінії соняшника: 96А/3, 16А/3, VK-121 (селекції Одеського селекційногенетичного Інституту та Запорізького Інституту олійних культур НААН України). Agrobacterium - опосередковану трансформацію проводили штамом нопалінового типу LBA4404, який несе бінарний вектор рВі2Е з дволанцюговим РНК-супресором гена проліндегідрогенази - pdh та селективним геном nptII (фіг. 1), наданим к.б.н. Кочетовим О.В. (Інститут цитології і генетики Сибірського відділення РАН, м. Новосибірськ). Суть корисної моделі пояснюють креслення. Фіг. 1. Блок-схема області Т-ДНК з дволанцюговим РНК-супресором гена проліндегідрогенази (pdh). Стрілками вказаний обернений повтор. До початку цвітіння кошики ізолювали пергаментними ізоляторами. Після повного дозрівання пилку, на приймочки маточок трубчатих квітів 1-7 рядів, наносили суспензію клітин агробактерії (оптична щільність 0,2-1,0 о.о.) та здійснювали запилення пилком тієї ж рослини. Для інокуляції суспензію клітин агробактерії розводили, використовуючи два варіанта середовищ: І - середовище Мурасіге і Скуга, модифіковане нами (доповнене тіосульфатом натрію) [4], та II - середовище, яке містило 12,5 мМ MES (2-(N-морфоліно-етан-сульфонову кислоту), 4 мМ NH4Cl, 5,5 мМ MgSO4, pH 5,7 [5]. Для підвищення ефективності інтродукції Т-ДНК до інокуляційного середовища додавали Silwet L-77 - поверхнево-активну речовину низької токсичності, яку застосовують при трансформації in planta (A.F. Bern, 2000). Для генетичної трансформації соняшника достатня концентрація цього детергента була 0,01 % (за об'ємом). При використанні середовищ для інокуляції переніс Т-ДНК у клітини генеративних тканин здійснювався без додаткової активації двокомпонентної регуляторної системи VirA-VirG ацетосирінгоном, що є економічно вигідним. Поєднуючи різні комбінації наведених середовищ для інокуляції, умови нанесення (методом ін'єкції на приймочку маточки в процесі запилення) та визначивши оптимальні концентрації суспензійної культури клітин агробактерії (0,2-1,0 о.о.), отримано сім'янки ТО-рослин вихідних інбредних ліній соняшника, які за морфометричними показниками не відрізнялися від контролю. 1 UA 86108 U 5 В результаті проведеної генетичної трансформації in planta з використанням обох середовищ для інокуляції у інбредних ліній 96А/3 та VK-121 було отримано насіння ТО покоління, в якому підтверджено присутність гена проліндегідрогенази (рис. 2). У генотипу VK121 наявність даного гена було підтверджено в насінні Т1 та Т2-покоління. Для молекулярно-генетичного аналізу використовували праймери представлені у табл. 1. [6, R 7]. ПЛР здійснювали на ампліфікаторі Mastercycler Personal 5332 (Eppendorf) за наступних умов (табл. 2). Таблиця 1 Послідовність праймерів до фрагмента 1-го екзону супресора гена pdh та vir-генів Ті-плазміди агробактерій Праймер VCF (F) VCR (R) F R Послідовність virC Ті-плазміди штаму LBA4404 5'-АТС ATT TGT AGC GAC Т-3' 5'-AGC ТСА ААС CTG СТТ С-3' фрагмент 1-го екзону супресора гена pdh 5'-ААС ААА CTG GAT CCG GCG АТС TTA C-3' 5'-GAG ATG TTG GTC TAG ATT TGG CAG C-3' Таблиця 2 Умови ПЛР ген virC екзон 1 денатурація, гібридизація, синтез, кінцева елонгація 94 °C-30с, 60/59 °C-30с, 72 °C-45с. 94 °C-30с, 53 °C-30с, 72 °C-35с. Очікувана довжина амплікону, п.н. 730 550 10 15 20 25 30 35 40 Електрофорез ДНК проводили в 1,2 %- або 0,8 %-ному агарозному гелях при напруженості 3-4 В/см у 0,5ТБЕ буфері з додаванням етидію броміду кінцевої концентрації 0,5 мкг/мл [8]. Як маркер застосовувались ДНК бактеріофага Lambda DNA/HindII або DNA LadderMix (Fermentas).(рис. 2, 3) Фіг. 2. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК інбредних ліній соняшника з використанням праймерів до першого екзону гена ProDH1 арабідопсису: 1 - листки Km-стійкого та 2-Km-нестійкого проростків Т1-покоління рослин інбредної лінії VK121, трансформованих in planta; 3-4-Km-нестійкі проростки Т1-покоління рослин інбредних ліній 96А/3, трансформованих in planta; 5-6-Km-стійкі пагони інбредної лінії 96-А/3, трансформованої ш vitro; 7 - позитивний контроль - ДНК Arabidopsis thaliana; 8 - негативний контроль (без ДНК); М - маркер молекулярної маси GeneRuler™ DNA Ladder Mix, Fermentas. Фіг. 3. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК листків рослин Т2 покоління інбредної лінії VK-121, трансформованої inplanta (1-9) з використанням праймерів до першого екзону гена ProDH1 арабідопсиса; 10 - позитивний контроль - ДНК обеззброєного штаму LBA4404; 11 - негативний контроль (без ДНК); М - маркер молекулярної маси GeneRuler™ DNA Ladder Mix, Fermentas. Слід підкреслити, що в ДНК трансгенних рослин соняшника, незалежно від середовищ для інокуляції та концентрації клітин суспензій агробактеріального штаму, були відсутні домішки агробактерії (фіг. 4), що підтверджує доцільність використання запропонованого способу Agrobacterium - опосередкованої трансформації in planta для генетичного поліпшення соняшника. Фіг. 4. Электрофореграма продуктів ампліфікації ДНК інбредних ліній соняшника з використанням праймерів до гена virC: 1 - листки Km - стійкого пагона Т1-покоління рослин інбредної лінії VK-121, трансформованого in planta, 2-4 - регенеранти соняшника, нестійкі до селективного маркера; 2 UA 86108 U 5 10 15 20 25 30 5,6-Km - стійкі регенеранти соняшника інбредної лінії 96-А/3; 7 - позитивний контроль - ДНК штамма LBA4404; 8 - негативний контроль (без ДНК); М - маркер молекулярної маси GeneRuler™ DNA Ladder Mix, Fermentas. Джерела інформації: 1. Чумаков М.И., Рожок Н.А., Беликов В.А. Трансформация кукурузы путем инокуляции агробактериями пестичных нитей in planta / и др. // Генетика. - 2006. - Т. 42, № 8. - С. 1083-1088. 2. Пат. 2351120 Российская Федерация, МПК А01Н 1/00, А01Н 4/00, C12N 15/82. Способ получения трансгенных растений кукурузы / Чумаков М.И.; заявитель и патентообладатель Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, Гос. образовательное учреждение высшего профобразования "Саратовский гос. ун-т им. Н.Г. Чернышевского", Федеральное агентство по науке и инновациям. - № 2007134281/13; заявл. 17.09.2007; опубл. 10.04.2009, Бюл. № 10. 3. Матвеева А.Ю., Сакало В.Д., Курчий В.М. и др. Активность сахаросинтетазы и инвертазы эндосперма кукурузы (Zea mays L.), инфицированной in planta обезоруженными штаммами Agrobacterium tumefaciens II Вісник Українського товариства генетиків та селекціонерів. - 2011. 9, № 1. - С. 55-64. 4. Комисаренко А.Г., Михальская С.И., Кочетов А.В., Тищенко Е.Н. Индукция регенерации in vitro при Agrobacterium - опосредованной трансформации инбредных линий подсолнечника // Біотехнологія. - 2010. - 3, № 4. - С. 67-74. 5. Albert В., Lucas О., Gall V.L. et al. Pectolytic enzyme treatment of sunflower explants prior to wounding and cocultivation with Agrobacterium tumerfaciens, enhances efficiency of transient βglucuronidase expression // Physiologia Plantarum. - 1999. - 106. - P. 232-237. 6. Кочетов A.B. Титов С.Е., Колодяжная Я.С и др. Повышение содержания пролина и осмотического давления клеточного сока у трансформантов табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика. - 2004. - Т. 40, №2. - С. 282-285. 7. Sawada H., Ieki H., Matsuda I. PCR detection of Ті and Ri plasmids from phytopathogenic Agrobacterium strains // Applied and environmental microbiology. - 1995. - Vol. 61, № 2-P. 828-831. 8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. - М.: Мир, 1984. - 480 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб застосування Agrobacterium - опосередкованої трансформації in planta, для отримання трансгенних рослин соняшника (Helianthus annuus L.), що включає перенесення цільового трансгена в геном соняшника, який відрізняється тим, що процесу трансформації піддають вегетуючі in vivo рослини, у яких на приймочку маточки трубчатих квітів в період запилення наносять суспензію агробактеріальних клітин, розведену у спеціальних середовищах для інокуляції (середовище І, II). 3 UA 86108 U Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4