Спосіб отримання трансгенних рослин кукурудзи за допомогою agrobacterium-опосередкованої трансформації in planta

Реферат: Спосіб отримання трансгенних рослин кукурудзи за допомогою Agrobacterium-опосередкованої трансформації in planta полягає у інокуляції клітин генеративних тканин кукурудзи обеззброєними агробактеріальними штамами. Для процедури трансформації застосовують середовище інокуляції, котре раніше використовують виключно у системі in vitro, до якого додають новий компонент - Silwet L-77, що створює можливість його використання для ряду штамів з різними векторними конструкціями та широкого спектра генотипів кукурудзи. UA 77331 U (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ ТРАНСГЕННИХ РОСЛИН КУКУРУДЗИ ЗА ДОПОМОГОЮ AGROBACTERIUMОПОСЕРЕДКОВАНОЇ ТРАНСФОРМАЦІЇ IN PLANTA UA 77331 U UA 77331 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить біотехнології, генетичної інженерії, сільського господарства. Може бути використана при отриманні стабільно трансформованих фертильних рослин для подальшого створення трансгенних ліній та гібридів кукурудзи з новими властивостями. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення методу генетичної трансформації з використанням обеззброєних штамів Agrobacterium tumefaciens для інтеграції трансгенів у геном господарсько-цінних інбредних ліній кукурудзи з різною здатністю до реалізації морфогенетичного потенціалу, а також прискореного економічно вигідного способу отримання біотехнологічних рослин з цільовими трансгенами. Методологія генетичної інженерії розкрила нові перспективи для генетичного поліпшення рослин. Не зважаючи на значні досягнення селекційно-генетичних програм по отриманню біотехнологічних рослин кукурудзи (Zea mays L.) та їх культивуванню, процедура генетичної трансформації більшості господарсько-цінних генотипів не є стандартною і надійно відтворюваною. Одне із головних її обмежень пов'язане з відсутністю ефективної регенерації in vitro. Тому очевидна потреба розробки прийомів та модифікації способів генетичної трансформації, які б дозволили обійти тривалі, трудомісткі та економічно витратні процедури культивування in vitro. Таким підходом можна вважати Agrobacterium - опосередковану трансформацію in planta [1, 2]. Суть способу полягає у нанесенні суспензії агробактеріальних клітин на відповідним чином підготовлені маточкові нитки із подальшим примусовим запиленням власним пилком рослини, яку трансформують, або пилком рослин того ж генотипу. Модифікації (поліпшення) методу Agrobacterium - опосередкованої трансформації створюються із метою підвищення частоти інтеграції цільових трансгенів, розширення спектра генотипів кукурудзи, рекомбінантних агробактеріальних штамів. Вже визначаються (декларуються) сталі компоненти систем інокуляції, наприклад ацетосирингон. Тобто з'являються передумови стандартизації методу. Це здійснюється за допомогою варіювання складу середовищ інокуляції та концентрації клітин агробактеріальної суспензії. Задачею корисної моделі є удосконалення методу генетичної трансформації, спрямоване на прискорене, економічно вигідне отримання трансгенних форм господарсько-цінних інбредних ліній кукурудзи з новими ознаками. Суть корисної моделі полягає у застосуванні при Agrobacterium - опосередкованій трансформації in planta середовища для інокуляції клітин генеративних тканин, ефективного одночасно як для фертилізації, так і для інтеграції рекомбінантних молекул ДНК у геном рослин широкого ряду інбредних ліній кукурудзи з використанням різних агробактеріальних штамів. При цьому гарантується отримання життєздатного насіння та добір генотипів, у насіннєвому поколінні яких наявні цільові трансгени. Приклад реалізації корисної моделі. При удосконаленні способу Agrobacterium - опосередкованої трансформації in planta, використовували інбредні лінії кукурудзи: 250, 370, 390, 1555, 1568. 1580. 1596, 1607, 1634, 2124 (селекції Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ). Процедуру трансформації проводили штамами: (1) LBA4404. рВі2Е, який містив дволанцюговий РНК-супресор гена проліндегідрогенази 1 Arabidopsis thaliana (prol) та селективний ген npt\\, отриманий від к.б.н. Кочетова А.В. (Інститут цитології і генетики Сибірського відділення РАН, м. Новосибірськ); (2) GV2260, рСВ002. який містив гени nptII і gusA й (3) GV3101, рІСН5290. який містив гени bar і gusA, отримані від член-кор. НАН України Кучука М.В. (Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України). Для інокуляції використовували модифіковане нами середовище наступного складу: 12,5 мМ MES (2-(N-морфоліно)етансульфонову кислоту), 4 мМ NH4Cl, 5,5 мМ MgSO4, pH 5,6, яке раніше застосовували виключно за Agrobacterium - опосередкованої трансформації in vitro [3], до якого додавали 0,01-0,025 % поверхнево-активну речовину Silwet L-77 ("Lehle Seed". США). Для молекулярно-генетичного аналізу використовували праймери, представлені у табл. 1, які були підібрані згідно з рекомендаціями Кочетова А.В. [4], Sawada H. та ін. [5] за наступних R умов (табл. 2) на ампліфікаторі Mastercycler personal 5332 (Eppendorf). Загальна схема умов ПЛР: попередня денатурація - 4 хв 94 °C, ампліфікація 35 циклів (денатурація, гібридизація, синтез), кінцева елонгація - 10 хв 72 °C. Електрофорез ДНК проводили в 1,2 %- або 0,8 %-ному агарозному гелі при напруженості 5 В/см у 0,5хТБЕ буфері з додаванням бромистого етидію кінцевої концентрації 0,5 мкг/мл [6]. Як маркер застосовувались Lambda ДНК/Я/m/III або GeneRuler™ DNA Ladder Mix (Fermentas). 1 UA 77331 U Таблиця 1 Послідовність праймерів до генів, які містяться у використаних векторних конструкціях та v/V-генів П-плазміди агробактерій Праймер F R VCF (F) VCR (R) F R F R F R F R Послідовність vіrD1 Ті-плазміди штамів GV2260 і GV3101 5'-ATG TCG САА GGC AGT AAG ССС А-3' 5'-GGA GTC ТТТ CAG CAT GGA GCA А-3' virC Ті-плазміди штаму LBA4404 5'-АТС ATT TGT AGC GAC Т-3' 5'-AGC ТСА ААС CTG СТТ С-3' ген nptll 5'-ССТ GAA TGA ACT CCA GGA GGA GGC A-3' 5'-GCT СТА GAT CCA GAG TCC CGC TCA GAA G-3' фрагмент 1-го екзону гена prol (prol-sx1) 5'-AAC AAA CTG GAT CCG GCG АТС TTA C-3' 5'-GAG ATG TTG GTC TAG ATT TGG CAG C-3' фрагмент 1-го інтрону гена prol (prol-inт1) 5'-AAC AAA CTG GAT CCG GCG АТС TTA C-3' 5'-ATT AAG CTT TCG AAC САА АСА AGT-3' ген bar 5'-GCG GTC TGC ACC АТС GTC AAC-3' 5'-CAG АТС TCG GTG ACG GGC AGG AC-3' Таблиця 2 Умови ПЛР для окремих генів Ген virD1 virC nptll prol-ex1 prol-int1 bar 5 10 15 20 Денатурація, гібридизація, синтез 94 °C -30 c., 57 °C - 1 хв., 72 °C - 15 с. 94 °C - 30 c., 60 °C - 30 c., 72 °C - 45 c. 94 °C - 30 c., 53 °C - 30 c., 72 °C - 30 c. 94 °C - 30 c., 53 °C - 30 c., 72 °C - 35 c. 94 °C - 30 c., 55 °C - 30 c. 72 °C - 45 c. 94 °C - 30 c., 59 °C- 1 хв., 72 °C - 18 c. Очікувана довжина амплікону, п. н. 432 730 649 550 700 494 В результаті проведеної генетичної трансформації з використанням середовища для інокуляції і різних типів обеззброєних штамів Agrobacterium tumefaciens для всіх проаналізованих інбредних ліній були отримані варіанти, в яких підтверджено присутність цільового гена у Т0- та/або Т1-поколіннях кукурудзи (фіг. 1, 2). Фіг. 1, 2 - ектрофореграма продуктів ампліфікації ДНК кукурудзи лінії 370 з використанням праймерів до першого екзону (а) й інтрону (б) гена prol арабідопсису, доріжки: 1 і 2 -ДНК пагонів 7-добових проростків відповідно Т0- і Т1 рослин; 3 -ДНК пагонів 7-добових проростків нетрансформованих рослин лінії 370; +К - позитивний контроль - загальна ДНК агробактеріального штаму LBA4404, рВі2Е; -К - негативний контроль; М - маркер молекулярних мас GeneRuler™ DNA Ladder Mix (Fermentas). Стрілками показано фрагменти першого екзону (а) й першого інтрону (б) гена prol, розмір яких відповідає очікуваній довжині 550 й 700 п. н., відповідно. Фіг. 3 - електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК инбредної лінії кукурудзи 370, трансформованої in planta з використанням праймерів до гена nptlh 1 - ДНК зернівок контрольних (нетрансформованих) рослин; 2 і 3 - ДНК зернівок рослин, трансформованих штамами GV2260, рСВ002 та LBA4404, рВі2Е, відповідно; 4 і 5 - ДНК листків рослин, відповідно стійких та нестійких до селективної концентрації канаміцина, (GV2260, рСВ002); 2 UA 77331 U 5 10 15 20 25 30 35 40 6 і 7 - ДНК, листків рослин, відповідно стійких та нестійких до селективної концентрації канаміцина, (LBA4404, рВЇ2Е); 8 - маркер молекулярних мас - Lambda ДІ IK/Hindlll; 9 - негативный контроль - ті ж самі умови без ДНК. Фіг. 4, 5 - електрофореграми продуктів ампліфікації ДНК генотипів інбредних ліній рослин кукурудзи, інфікованих in planta штамом GV3101, рІСН5290, отриманих з використанням праймерів до гена bar, доріжки: 1, 3, 6, 10-11, 14, 19 - ДНК листків контрольних (нетрансформованих рослин) 250, 390, 1568, 1555, 1580, 1634, відповідно; 2, 4-5, 7, 12-13, 15, 20 - ДНК листків рослин 250, 390, 1568, 1555, 1580, 1634, інфікованих in planta штамом GV3101, рІСН5290; М - маркер молекулярних мас - Lambda ДНК/Hindlll (Fermentas); 8, 16 - негативні контролі (ті ж умови ампліфікації без ДНК): 17 - позитивний контроль - ДНК рослини ріпаку, трансформованої GV3101, рІСН5290. Стрілкою показано очікуваній амплікон гена bar розміром 494 и.н. Відсутність агробактеріальних домівок підтверджена результатами ПЛР-аналізу (фіг. 4). Фіг. 6 - електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК, виділеної з листків 20-добових рослин кукурудзи ліній 250 (доріжки 1, 2). 370 (доріжки 3, 4). 1555 (доріжки 5, 6), трансформованих in planta штамом GV2260, pCB002. ч використанням праймерів до агробактеріального гена v/rD1; 7 і 8 - позитивні контролі, 9 - негативний контроль. М - маркер молекулярних мас Lambda ДНК////тЛІІ (Fermentas); Стрілкою показано фрагмент, розмір якого відповідає очікуваній довжині 432 п.н. Джерела інформації: 1. Чумаков М.И. Трансформация кукурузы путем инокуляции агробактериями пестичных нитей in planta I М.И. Чумаков, Н.А. Рожок, В.А. Беликов и др. // Генетика. - 2006. - Т. 42, № 8. С. 1083-1088. 2. Пат. 2351120 Российская Федерация. МПК А01Н1/00. А01Н4/00, C12N15/82. Способ получения трансгенных растений кукурузы / Чумаков М.И.; заявитель и патентообладатель Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, Гос. образовательное учреждение высшего профобразования "Саратовський гос. ун-т им. Н.Г. Чернышевского", Федеральное агентство по науке и инновациям. - № 2007134281/13; заявл. 17.09.2007; опубл. 10.04.2009. Бюл. № 10. 3. Albert В. Pectolytic enzyme treatment of sunflower explants prior to wounding and cocultivation with Agrobacterium tumerfaciens, enhances efficiency of transient/i-glucuronidase expression / B. Albert. O. Lucas. V.L. Gall et al. // Physiologia Plantarum. - 1999. - 106. - P. 232-237. 4. Кочетов А.В. Повышение содержания пролина и осмотического давления клеточного сока у трансформантов табака, несучих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы / А.В. Кочетов. С.Е. Титов, Я.С. Колодежная и др. // Генетика.-2004. - Т. 40, № 2. - С. 282-285. 5. Sawada Н. PCR Detection of Ті and Ri Plasmids from Phytopathogenic Agrobactehum Strains / H. Sawada, H. Ieki, I. Matsuda // Applied and Environmental Microbiology. - 1995. - Vol. 61, № 2. - P. 828-831. 6. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук - М.: Мир, 1984. - 480 с. 45 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 Спосіб отримання трансгенних рослин кукурудзи за допомогою Agrobacterium-опосередкованої трансформації in planta, який полягає у інокуляції клітин генеративних тканин кукурудзи обеззброєними агробактеріальними штамами, який відрізняється тим, що для процедури трансформації застосовують середовище інокуляції, котре раніше використовують виключно у системі in vitro, до якого додають новий компонент - Silwet L-77, що створює можливість його використання для ряду штамів з різними векторними конструкціями та широкого спектра генотипів кукурудзи. 3 UA 77331 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4