Пептидна сполука з біологічною активністю, спосіб її отримання і її застосування

1. Пептидна сполука, яка має антимікробну активність і може бути отримана культивуванням Bacillus clausii у відповідному поживному середовищі аж до споруляції, збором супернатанту від культивування після центрифугування і фільтрації, і екстракцією фракції з антимікро бною активністю, яка відрізняється тим, що вона включає наступну амінокислотну послідовність: Phe-Dhb-Ala-Val-Dha-Phe-Ala-Abu-Pro-GIy-AIaGly-Glu-Dhb-Gly-Ala-Phe-Asn-Ala-Phe-AIa, в якій: Dhb представляє дидегідроамінобутират; Dha представляє дидегідроаланін; Abu представляє амінобутират. 2. Сполука за п. 1, яка відрізняється тим, що вона має молекулярну вагу 2107,5 Да. 3. Сполука за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що вона є лантибіотиком і має лантіонінові містки і модифіковані амінокислоти. 4. Сполука за будь-яким з пп. 1-3, яка відрізняється тим, що вона має двалантіонінових містка, 2 (19) 1 3 92793 4 Даний винахід належить до пептидної сполуки з біологічною активністю, зокрема, яка має антимікробні властивості, її отримання і до її застосувань. Відомо, що певні живі мікроорганізми, коли вводяться людям або тваринам, здатні надавати сприятливий вплив на здоров'я організму, зокрема, продукуючи антимікробні речовини. Такі організми звичайно називають пробіотичними організмами. Численні дослідження показали сприятливі впливи цих пробіотичних організмів на людей або тварин, особливо при лікуванні шлунковокишкових порушень, таких як діарея, гостра діарея, і діарея, пов'язана з використанням лікарських препаратів. Пробіотичні організми, найбільш вивчені до цього часу, є молочнокислими бактеріями, але було також повідомлено, що інші живі організми можуть мати сприятливий вплив на здоров'я. Ці інші організми включають, наприклад, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus cereus, Bacillus clausii, Bacillus polyfermentans. Серед них Bacillus clausii використовувалися багато років в фармацевтичному препараті, який продається під торговою маркою Enterogermina®. Цей фармацевтичний препарат призначений, зокрема, для боротьби з шлунково-кишковими порушеннями і включає суміш чотирьох штамів Bacillus clausii. Антимікробна біологічна активність цих пробіотичних організмів звичайно пов'язана з природним продукуванням сполук з антимікробною активністю, таких як лантибіотики. Таким чином, штами Bacillus clausii, Streptomyces mutans, Lactococcus lactis продукують відповідно субтилін, мутацини і низини, відповідно. Численні антибіотики використовуються в цей час як терапевтичні речовини для лікування інфекційних хвороб, але хвороботворні організми стають все більш стійкими до фармацевтичних препаратів, які використовуються. Деякі з них, як вже відомо, "стійкі до багатьох препаратів", і іноді надзвичайно важко лікувати інфекції, які вони викликають. Тому постійно розшукуються нові молекули, що мають антибіотичні властивості. Мета винаходу полягає в тому, щоб задовольнити цій вимозі, пропонуючи сполуку з антимікробною активністю, отримане з Bacillus clausii. Перший об'єкт винаходу належить до сполуки з антимікробною активністю. Другий об'єкт винаходу належить до способу отримання сполуки з антимікробною активністю за винаходом. Третій об'єкт винаходу належить до фармацевтичного препарату, який містить сполуку з антимікробною активністю за винаходом. Четвертий об'єкт винаходу належить до використання сполуки з антимікробною активністю за винаходом. Згідно з першим аспектом, винахід належить до сполуки з антимікробною активністю. Таким чином, молекула, яка продукується Bacillus clausii, і яка показує антимікробну активність, була виділена і охарактеризована. Сполука за винаходом з антимікробною активністю має природу пептиду і може бути отримана з культури Bacillus clausii у відповідному поживному середовищі аж до споруляції, збору супернатанту культури після центрифугування і фільтрації і екстракцій фракції з антимікробною активністю. Сполука за винаходом, яка є, головним чином, активною проти грампозитивних бактерій, може бути отримана з Bacillus clausii, і має молекулярну масу 2107,5 Да, визначену мас-спектометрією з лазерно-десорбційною іонізацією в присутності матриці і з часопролітним мас-аналізатором з іонізацією електророзпилюванням (метод MALDI TOF і ESI). Згідно з іншою характеристикою, сполука за винаходом є лантибіотиком і має лантіонінові містки і змінені амінокислоти в пептидній послідовності. Згідно з однією з її характеристик, сполука за винаходом включає наступну послідовність амінокислот і амінокислотних похідних: Phe-Dhb-Ala-ValDha-Phe-Ala-Abu-Pro-Gly-Ala-Gly-Glu-Dhb-Gly-AlaPhe-Asn-Ala-Phe-Ala, в якій Dhb являє собою дидегідроамінобутират; Dha являє собою дидегідроаланін; Abu являє собою амінобутират. Сполука за винаходом має два лантіонінових містка, один між аланіном в положенні 3 і аланіном в положенні 7, і інший між аланіном в положенні 16 і аланіном в положенні 21. Крім того, метил-лантіоніновий місток присутній між залишком амінобутирату в положенні 8 і аланіном в положенні 11. Четвертий місток присутній між С-кінцевою групою аміновінілцистеїну і залишком аланіну в положенні 19. Представлена з містками, які має, сполука за винаходом має наступну послідовність: в якій Dha, Dhb і Abu визначені вище. Згідно з другим аспектом, винахід належить до способу отримання сполуки з антимікробною активністю за винаходом. Згідно з винаходом, сполука за винаходом може бути витягнута з Bacillus clausii наступним способом. Спосіб отримання сполуки за винаходом включає стадії: 5 92793 6 - культивування штамів Bacillus clausii у відпоі людям для профілактики або для лікування згавідному поживному середовищі аж до споруляції даних вище порушень або хвороб. штамів; Відповідні дозовані одиниці включають форми - збір супернатанту від культивування після для перорального шляху введення, такі як таблетцентрифугування і фільтрації; ки, м'які або тверді капсули, порошки, гранули і - екстракції отриманої фракції твердою фазою пероральні розчини або суспензії; під'язикові, заі елюювання. щічні, ендотрахеальні, внутрішньоочні, носові і У разі необхідності, отримана фракція, яка віформи інгаляційного введення; місцеві, трансдердповідає молекулі винаходу, може бути очищена мальні, підшкірні, внутрішньом'язові або внутрішвисокоефективною рідинною хроматографією ньовенні форми введення; ректальні форми вве(ВЕРХ). дення, і імплантати. Для місцевого застосування Згідно з іншим варіантом, сполука за винахосполуки за винаходом можуть використовуватися дом може бути отримане звичайним хімічним синв кремах, гелях, мазях або лосьйонах. тезом, способами, відомим фахівцеві в технології. Композиція за винаходом може вводитися Сполука за винаходом показує антимікробну найбільш відповідним шляхом і в дозі, яка залеактивність проти грампозитивних бактерій. Зокрежить, зокрема, від природи інфекції, від типу оргама вона показала антимікробну активність проти нізму, який роглядається, від віку організму, тяжкоS. aureus, Enterococcus faecium, Micrococcus sp, сті і загального стану, від отримуваного супутнього Lactococcus lactis, Clostridium difficile, Clostridium лікування, так само як від реакції організму на ліperfringens, Listeria monocytogenes і грампозитивкування і від терапевтичного обґрунтування. них бактерій ротової порожнини. Загалом, для введення людям, препарат заВ результаті її лантибіотичного характеру спостосовується перорально в формі фармацевтичлука за винаходом може показати більш широкий ного препарату спор. Наприклад, доза може стаспектр біологічної активності, наприклад, противіновити приблизно 10 109 спор щоденно, русної, протипаразитарної або імуномодулюючої наприклад, від 1 до 8 109 спор щоденно, зокрема, активності. 2,4 або 6 109 спор щоденно, в єдиній дозі або в Отже, сполука за винаходом може, застосовудекількох дозах. ватися для приготування лікарських продуктів. Можуть бути особливі випадки, в яких більш Таким чином, згідно з іншим аспектом винахід високі або більш низькі дози є адекватними; такі належить до лікарських продуктів, які містять сподози також представляються в рамках винаходу. луку за винаходом. Згідно з іншим з його аспектів, винахід налеЦі лікарські продукти знаходять застосування жить до застосування сполуки за винаходом для в терапії, зокрема, при лікуванні і профілактиці отримання лікарського продукту, призначеного для інфекційних хвороб. профілактики і (або) лікування патологій, описаних Ці лікарські продукти також знаходять застосувище. вання при лікуванні і (або) профілактиці кишкових Згідно з іншим з його аспектів, винахід також порушень, наприклад, при лікуванні і профілактиці належить до методу лікування вищевикладених кишкового дисбіозу і ендогенного вітамінного попатологій, який включає введення хворому ефекрушення, так само як при додатковому лікуванні тивної дози сполуки за винаходом. для відновлення кишкової бактерійної флори, яка Згідно з іншим аспектом, сполука за винахобула змінена в результаті антибіотикотерапії або дом може також використовуватися як добавка в хіміотерапії. косметичних і харчових препаратах. Вони також знаходять застосування при проЗгідно з цим застосуванням, сполуку за винафілактиці і лікуванні діареї, зокрема, специфічної ходом додають в кількості, достатній, щоб інгібугострої діареї і діареї, пов'язаної з використанням вати збільшення бактерійного зростання в космелікарських продуктів. тичному або харчовому препаратах і, таким чином, Згідно з іншим аспектом, винахід належить до забезпечити їх збереження. фармацевтичних препаратів, який включає як діюПриклади, дані нижче, ілюструють винахід, хоч че начало сполуку за винаходом, для лікування і не обмежують його. (або) профілактики патологій, описаних вище. Ці 1. Отримання молекули фармацевтичні препарати містять ефективну дозу Отримання супернатанту сполуки за винаходом, так само як щонайменше Штам О/С Bacillus clausii (отриманий з фармаоднин фармацевтично ефективний ексципієнт. цевтичного препарату, який продається під торгоВказані ексципієнти вибирають згідно з фарвою маркою Enterogermina®) культивують протямацевтичною формою і бажаного шляху введення гом трьох днів на поживному середовищі Mueller з традиційних ексципієнтів, які відомі фахівцеві в Hinton при 37°С і 180об./хвилину, доти, поки спотехнології. руляція штаму не буде мати місце. У фармацевтичних препаратах за даним винаКультуру потім центрифугують і супернатант ходом для перорального, під'язикового, підшкірнофільтрують з використанням мембрани з розміром го, внутрішньом'язового, внутрішньовенного, топіпор 0,45 мкм, щоб видалити будь-які залишкові чного, місцевого, ендотрахеального, носового, клітини. трансдермального або ректального введення, Екстракція сполука може застосовуватися в дозованих одиСполуку з антимікробною активністю екстраницях, змішана із звичайними фармацевтичними гують на твердій фазі на патроні Sep Pak plus С18 інертними наповнювачами для введення тваринам (Waters). Для цього 150мл супернатанту, отриманого в попередній стадії, наносять на патрон і 7 92793 8 елююють 100%-им метанолом, після трьох посліми фазами. Зниження, тільки часткове, в активнодовних промивок з допомогою 25мМ NH4HCO3, сті, виміряне в кінці менш інтенсивної обробки, рН8; 25мМ NH4HCO3, рН8+10%-ий метанол і 25мМ такої як інкубація при нейтральному рН в присутNH4HCO3, рН8+50%-ий метанол. ності 25мМ дитіотреїтолу (DTT), може бути реВсі активні фракції, елюйовані 100%-им метазультатом певного відновлення дидегідроамінокинолом, об'єднують і концентрують вакуумним вислот, присутніх в структурі. Ці спостереження паровуванням, доти, поки не отримують чинник дозволяють сформулювати гіпотезу, згідно з якою скорочення об'єму 10. антимікробна молекула, зроблена Bacillus clausii, є Концентрат зберігає при -20°С. Ніякої втрати лантибіотиком. Це сімейство антибіотиків звичайактивності не спостерігалося після 6 місяців зберіно характеризується наявністю лантіонінових містгання в цих умовах. ків і модифікованих амінокислот в їх структурі. Очищення Секвенування природної молекули Очищення до стану гомогенності речовини, Секвенування виконане з використанням аввитягнутого твердою фазою, виконують ВЕРХ. томатичного секвенатора Procise 492 A (Applied Першу напівпрепаративну стадію виконують Biosystem), за допомогою ступінчастої деградації Едмана, починаючи з N-кінця. Отримані фенілтіона колоні С4 Synchropack 100 8мм. Фракції елюагідантоїнові (ФТГ) похідні амінокислоти аналізують ту, які показують антимікробну активність, збираз допомогою ВЕРХ із зверненими фазами на мікють і об'єднують. Чистота сполуки, отриманої в роколонці С18. Секвенування антибіотичні молекінці цієї стадії, більше 80% і вихід в екстракції кули, в природному стані, блокують в кінці першої очищенню становить приблизно 6мг І-1 супернатастадії хімічної деградації Едмана. Єдиний ідентинту. фікований залишок відповідає фенілаланіну, який Другу аналітичну стадію виконують на колоні займає N-кінцеве положення. С1 Bischoff 150 4,6мм. Фракції елюату які показуСеквенування молекули після хімічної модифіють антимікробну активність, збирають і об'єднукації ють. Чистота сполуки, отриманої в кінці цієї стадії, Інформація, яка стосується потенційної послібільше 90%. довності нової антимікробної речовини, зробленої 2. Структурне дослідження Bacillus clausii, отримана з послідовності кодуючоВизначення ваги молекули го гена, сполучена з інформацією, отриманою з Очищена сполука, отримана в Прикладі 1 вианалізу амінокислотного складу і з поведінки у ще, має молекулярну вагу 2107,5Да, визначений відновлюваному середовищі, показує наявність мас-спектометрією, використовуючи метод MALD поттрансляційних модифікацій, характерних для TOF, і підтверджений мас-спектометрією, викорислантибіотиків. товуючи метод ESI. Наявність дидегідроамінокислот і лантіоніноУФ/видимий спектр поглинання вих містків в структурі є початком блокування секСполука за винаходом поглинає в ультрафіовенування молекули в природному стані. Дегідролеті і має, зокрема, пік при 265нм, сумісний з наяамінокислоти, такі як Dha (дидегідроаланін) і Dhb вністю ароматичних амінокислот в його структурі. (дидегідроамінобутират) дезамінуються під час Амінокислотний склад хімічної деградації Едмана і, таким чином, блокуПісля повного гідролізу під дією 5,7 Η НСl, під ють прогрес секвенування. Ці ті ж самі залишки вакуумом, протягом 16 годин при 115°С, наявність Dha і Dhb не виявляються аналізом амінокислотрізних амінокислот визначають в структурі очищеного складу після повного кислотного гідролізу за ної сполуки. тих самих причин, а їх дезамінування робить нееДослідження різних енантіомерних форм аміфективною реакцію дериватизації з 6-амінохінолілнокислот N-гідроксисукцинимідил карбаматом (AQC) Енантіомерні L і D форми амінокислот, які (Waters), специфічної для функції первинного аміскладають послідовність сполуки з антимікробною ну. активністю, були досліджені після повного кислотЗ метою подолання проблем, пов'язаних з ного гідролізу, дериватизацією з Nа-(2,4-динітро-5присутністю модифікованих амінокислот і лантіофторфеніл)-L-аланінамідом (реактив Мерфі) згідно нінових містків, подвійна хімічна реакція була заз методом, описаним Szokan (J. Chromato., 1988, стосована до пептидного антибіотика до його сек444, стор.115-122). Результати вказують, що всі венування. Метод, який використовується був залишки амінокислот, які складають антибіотичну запозичений з роботи Сміта (Smith), Eur. J. молекулу, є енантіомерами L форми. Biochem. 2000, 267, p.6810-6816. З цією метою, Вплив ферментативних або хімічних обробок 50нмоль очищеного пептиду завантажують в на структуру 10мкл Н2О+4мг NaBH4. Додають 190мкл розчини Повна втрата активності після ферментативної для денатурування з антиоксидантом (570мг хлообробки Проназою підтверджує пептидний харакриду гуанідину +0,1мл N-етилморфоліну, доведетер нового антибіотичної сполуки. ного водою Н2О до рН8,5 до кінцевого об'єму 1мл), Дисульфудні містки виключаються, оскільки потім реакційну суміш культивують в потоку N2 цистеїн-специфічний аналіз виявився негативним. протягом 72 годин при 37°С. Навпаки, наявність лантіонінових містків, чутливих Ця обробка специфічно відновлює дидегідродо відновної обробки в лужному середовищі амінокислоти, не ушкоджуючи лантіонінові містки. (Meyer, Anal. Biochem, 223, стор.185-190, 1994), Таким чином відновлений пептид виділяють на може пояснити втрату активності, яка спостерігаколонці Prosorb (Perkin Elmer), забезпеченій мемється в присутності β-меркаптоетанолу після струбраною PVDF. Після промивки мембрани 200мкл ктурної модифікації, виявленої ВЕРХ із звернени 9 92793 10 0,1% трифтороцтової кислоти (ТФК), пептид, адмає 4 лантіонінових містка і метил-лантіонін, так сорбований на цій підкладці, піддають другому само як 3 залишку дидегідроамінокислоти, в струквідновленню в присутності етантіолу (додання турі. Структура знаходиться в згоді із знайденою 20мкл розчину, що включає 280мкл метанолу масою, 2107,5Да, з результатами, отриманими +200мкл Н2О+65мл NaOH+60мкл етантіолу протяпісля виконання хімічних модифікацій на молекулі, гом однієї години при 50°С. і з послідовністю амінокислот, виведеною на осноКовалентна структура антибіотичні молекули, ві гена, який кодує її продукцію, знайденого в В. зробленої Bacillus clausii clausii. Структура була підтверджена аналізом Ковалентна структура знаходиться в згоді з ЯМР. всіма отриманими даними. Молекулярна маса, Інші три штаму (N/R, SIN, Τ) Bacillus clausii, обчислена на основі маси моноізотипних залишків, присутні в фармацевтичному препараті становить 2107,5 Да. Антимікробна молекула, яка Enterogermina®, показали той же самий профіль секретується Bacillus clausii, є лантибіотиком, що антимікробної активності, як штам О/С. Комп’ютерна верстка Т. Чепелева Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601