Спосіб визначення рівня специфічних антитіл проти збудників сальмонельозу (salmonella typhimurium і salmonella dublin) у великої рогатої худоби, овець і морських свинок за допомогою реакції непрямої імунфлуоресценції

Реферат: Спосіб визначення рівня специфічних антитіл до антигенів S. typhimurium і S. dublin в сироватці крові тварин (великої рогатої худоби, овець, морських свинок) включає використання як тестсистеми непрямого варіанта методу флуоресціюючих антитіл. Найвище розведення досліджуваної сироватки, яке дає діагностичне свічення тест-штаму, приймають за показник рівня специфічних антитіл. UA 94001 U (12) UA 94001 U UA 94001 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології, імунології, епізоотології та лабораторної діагностики інфекційних захворювань, зокрема до методів вивчення імунного статусу тварин та методів контролю антигенності та імуногенності вакцин проти сальмонельозу на великій рогатій худобі, вівцях, морських свинках шляхом визначення титрів антитіл до антигенів S. typhimurium і S. dublin - збудників сальмонельозу. Проблема сальмонельозу в останні роки набуває все більш виражене медико-ветеринарне значення, що зв'язано, в першу чергу, із збільшенням інфікованості сальмонелами домашніх тварин і птиці. Жодна країна не ставить питання про повне знищення сальмонельозної інфекції. Цьому в значній мірі сприяє висока стійкість і контагіозність збудника, широкий спектр сприйнятливих тварин і шляхів передачі збудника інфекції, значна генетична пластичність і живильна невибагливість сальмонел (Рыбальченко О.В. Энтеробактерии - возбудители инфекционных заболеваний человека. - СПб.: Изд-во С.-Петерб. Унта, 2003.; Куликовский А.В. Актуальность проблемы сальмонеллеза. // Вопросы питання. - 1991.). Все це призвело до виникнення значної кількості його сероваріантів і значного поширення сальмонел в навколишньому середовищі, що постійно створює загрозу виникнення захворювання. Незважаючи на тривалий період часу вивчення, проблема сальмонельозних інфекцій не утратила своєї значимості і в наш час (Стегний Б.Т. Значение сальмонеллезов птиц в ветеринарной медицине // Ветеринарная медицина. - 2002. - № 80; Куриленко А., Пименов Н. Роль редких для России видов сальмонелл в возникновении инфекции у свиней // Ветеринария сельскохозяйственных животных - 2008). Особливістю інфекційного процесу при цій хворобі є наявність таких станів як бактеріоносійство та імунізуюча субінфекція. Вважають, що вирішальну роль у формуванні природної та набутої резистентності проти сальмонельозу відіграють антитіла. Для визначення рівнів антитіл проти збудника сальмонельозу використовують реакцію аглютинації (В.М. Івченко, Т.В. Шарандак та ін. Методи імунологічних досліджень в лабораторіях ветеринарної медицини. - Біла Церква, 2007). Ця реакція є простою у виконанні, але вона виявляє лише повні антитіла. Неповні антитіла, які відіграють не менш важливу роль у формуванні імунітету при сальмонельозі, залишаються поза увагою. Виявити їх можна з допомогою реакції непрямої імунофлуоресценції. Застосування цих двох реакцій в комплексі дозволить не лише більш повно характеризувати інфекційний процес, але й ефективно контролювати стан активного імунітету в імунізованих тварин. Задачею корисної моделі є розробка експрес-методу визначення рівня антитіл до антигенів S. typhimurium і S. dublin в сироватці крові тварин для оцінки їх імунологічного статусу та оперативного контролю антигенності та імуногенності вакцинних препаратів, виготовлених з S. typhimurium і S. dublin. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалення способів визначення рівня специфічних антитіл проти збудників сальмонельозу (S. typhimurium і S. dublin) в сироватці крові тварин за допомогою реакції непрямої імунофлуоресценції (РНІФ). Поставлена задача вирішується тим, що шляхом визначення титрів специфічних антитіл до антигенів S. typhimurium або S. dublin в сироватці крові тварин, які перехворіли чи були вакциновані проти сальмонельозу, за допомогою РНІФ. Суть РНІФ для визначення титру антитіл до антигенів S. typhimurium і S. dublin в досліджуваних сироватках крові тварин ґрунтується на візуальному виявленні специфічного свічення не менше ніж на два хрести мікробних клітин S. typhimurium або S. dublin на препаратах, оброблених на першому етапі досліджуваними сироватками в різних розведеннях, а на другому - міченими антивидовими глобулінами (Бусыгин К.Ф. Люминесцентная диагностика инфекционных болезней животных.- М.: Колос, 1975). При цьому, чим вищі титри специфічних антитіл в досліджуваній сироватці, тим у вищому розведенні буде виявлятися специфічне свічення. Спосіб флуоресціюючих антитіл на відміну від ряду інших імунологічних реакцій виявляє всю гаму специфічних (повних і неповних) антитіл. Перевагами способу є: - висока чутливість, бо дозволяє виявляти не лише повні, але й неповні антитіла; - висока об'єктивність обліку результатів, бо він поєднує в собі переваги мікроскопії з високою специфічністю імунологічних реакцій; - відносно швидка постановка реакції, що дозволяє віднести його до розряду експресметодів лабораторної діагностики. Цей спосіб дає можливість провести оцінку імунного статусу сприйнятливих до сальмонельозу тварин, що є важливим критерієм комплексного підходу в організації та проведенні протиепізоотичних заходів в неблагополучних пунктах, а також виявити тваринсальмонелоносіїв і тварин, що перебувають у стані імунізуючої субінфекції. 1 UA 94001 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В доступній літературі не знайдено робіт, присвячених використанню РНІФ для визначення рівня антитіл проти збудників сальмонельозу. Спосіб визначення титрів антитіл до антигенів S. typhimurium і S. dublin в досліджуваних сироватках крові тварин з допомогою РНІФ зводиться до наступного. Як досліджуваний матеріал служить свіжа не гемолізована сироватка крові великої рогатої худоби, овець, морських свинок. Взяття крові, обведення кров'яного згустку, відбір сироватки проводять за загально прийнятою методикою. 3 В пластикових планшетах із лунками об'ємом 2-3 см роблять 2-кратні розведення досліджуваної сироватки на 0,85 %-ому розчині натрію хлориду з рН 7,4, починаючи з розведення 1:2 - у першій лунці. Тоді готують препарати для люмінесцентної мікроскопії. Для цього на 0,85 %-ому розчині натрію хлориду роблять суспензію тест-мікроба з концентрацією 250 000-500 000 мікробних 3 клітин в 1 см . На предметному склі, розграфленому восковим олівцем на 6 квадратів, з допомогою бактеріологічної петлі роблять мазки із суспензії тест-мікроба, висушують на повітрі і фіксують на полум'ї спиртівки або газового пальника як при звичайній світловій мікроскопії, або метанолом протягом 10 хв. при кімнатній температурі, або етанолом протягом 20 хв. при 37 °C, або сумішшю Никифорова протягом 10 хв. при 37 °C. На кресленні зображено схему виготовлення препаратів для люмінесцентної мікроскопії, де 1 - нумерація препарату (С1 - означає, що досліджувана сироватка, зразок 1-ий; цифри:2-64 вказують, що тут будуть випробувані розведення сироватки від 1:2 до 1:64), 2 - роздільні лінії, нанесені восковим олівцем, 3 - поля нанесення мазків тест-мікроба, 4 - предметне скло. 3 На фіксовані препарати наносять по 0,1 см досліджуваної сироватки відповідних розведень, починаючи з найвищих розведень, витримують в термостаті в умовах вологої камери протягом 30 хв., промивають 0,85 %-вим розчином натрію хлориду (рН 7,4) протягом 10 хв., двічі змінюючи розчин. Залишки рідини підсушують фільтрувальним папером і наносять мічені ізотіоціанатом флуоресцеїну антивидові глобуліни (якщо досліджують кров великої рогатої худоби, то використовують мічені глобуліни проти білків крові великої рогатої худоби, якщо овець - то мічені глобуліни проти білків крові овець, якщо морських свинок - то мічені глобуліни проти білків крові морських свинок) в робочому розведенні. Оброблені препарати витримують в умовах вологої камери при 37 °C протягом 30 хв. і промивають 0,85 %-вим розчином натрію хлориду (рН 7,4) протягом 10 хв., двічі змінюючи розчин. Підсушують фільтрувальним папером і висушують на повітрі. Перед мікроскопією на кожне досліджуване поле препарату наносять краплю 90 %-ого водного розчину гліцерину на дистильованій воді (рН 9,0-9,5) і накривають тонким покривним склом. На покривне скло наносять краплю не флуоресціюючої олії або диметилфталату. Препарати проглядають під люмінесцентним мікроскопом, використовуючи світлофільтри ЖС18, СЗС-24-4 і ФС-1-1 при збільшенні 630 і силі струму 3-4,5 А. Інтенсивність люмінесцентного свічення мікробних клітин оцінюють за 4-хрестовою системою: ++++ - сіяюче німбоподібне свічення мікробної клітини; +++ - яскрава люмінесценція периферії мікробної клітини; ++ - слабо виражене контуроване свічення периферії клітини; + - дуже слабе гомогенне свічення клітини, без видимого контуру. Діагностичним вважають розведення сироватки, при якому отримано світіння мікробних клітин тест-мікроба не менше, ніж на 2 хрести. Примітка: Дослідження препаратів під люмінесцентним мікроскопом можна проводити і без нанесення 90 %-ого водного розчину гліцерину на дистильованій воді (рН 9,0-9,5). При цьому інтенсивність свічення буде дещо слабшою. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення рівня специфічних антитіл до антигенів S. typhimurium і S. dublin в сироватці крові тварин (великої рогатої худоби, овець, морських свинок), який включаєвикористання як тест-системи непрямого варіанта методу флуоресціюючих антитіл, який відрізняється тим, що найвище розведення досліджуваної сироватки, яке дає діагностичне свічення тест-штаму, приймають за показник рівня специфічних антитіл. 2 UA 94001 U Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3