Тест-система для кількісного визначення лабільного та загального заліза в плазмі крові

Реферат: UA 94397 U UA 94397 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до експериментальної біології і може бути використана в науково-дослідницькій практиці та в клініко-діагностичних і біохімічних лабораторіях для фотометричного визначення в зразках плазми чи сироватки крові вмісту як лабільного заліза (не зв'язаного з трансферином, що утворюється при вивільненні з тканини м'язів та/або органів гемвміщуючих протеїнів при рабдоміолізі, внутрішньому крововиливу та ін.), так і зв'язаного заліза. В плазму крові залізо надходить з шлунково-кишкового тракту у відновленому стані та утворює нестійкі залізо-сірчані комплекси з альбуміном. Церулоплазмін (ЦП) окиснює це залізо та сприяє його зв'язуванню у трансферині (ТР, білка плазми крові, який є одним з основних +2 +3 +3 +3 перенощиків заліза): Fe +ЦП→ЦП-Fe →ЦП-Fe -TP→Fe -TP, де залізо екрановано від хімічної взаємодії. Важливо, що за фізіологічних умов (рН 7,4) до ТР можливе включення лише 2+ 2+ іонів заліза Fe та лише за безпосередньої участі ЦП. Самостійне включення заліза як Fe , так 3+ і Fe до ТР за фізіологічних умов неможливе. Якщо внаслідок ряду патологічних процесів, наприклад, при руйнуванні міозитів (рабдоміоліз) або при дії різноманітних окислювачів, в 3+ плазмі крові з'являється лабільне (не включене до ТР) залізо Fe , воно випадає з фізіологічної схеми обміну заліза, тому що ЦП взаємодіє тільки з двовалентним залізом. У таких випадках 3+ лабільне залізо Fe здатне накопичуватися в крові та посилювати окисні процеси. Таким чином, за фізіологічних умов у плазмі крові може знаходитись лабільне залізо лише у вигляді Fe, яке 3+ швидко включається до ТР, а за певних патологій - Fe , яке вже не може бути включене до ТР [1]. Відомо про набір реактивів для точного визначення вмісту лабільного заліза в крові методом проточної цитофлуорометрії з флуоресцентною міткою [2]. Проте для застосування такого набору реактивів необхідним є використання дорогого устаткування та реактивів (флуоресцентна мітка, проточний цитофлуориметр). Найближчим аналогом тест-системи, що заявляється, є набір реактивів для фотометричного визначення заліза та залізозв'язуючої здатності [3]. До складу набору входить: - буферний розчин з рН від 4.5 до 5.0 (1 флакон - 100 мл); - кольорореагент (1 пробірка - 2 мл): феррозин (20±2) г/л; - калібрувальний розчин заліза (1 флакон - 8 мл) - (20±0.5) мкмоль/л; - насичуючий розчин заліза (1 флакон - 50 мл) - (90±10) мкмоль/л; - сорбент (1 флакон - 10 г): лужний карбонат магнію; - деіонізована вода (1 флакон - 8 мл). Проте даний набір реактивів призначений для визначення лише загального заліза в плазмі крові (лабільного та зв'язаного з трансферином). Задачею корисної моделі, що заявляється, є розробка тест-системи для кількісного селективного визначення лабільного та загального заліза в плазмі крові простим, надійним і доступним методом. Поставлена задача вирішується шляхом додаткового введення до складу набору реактивів за найближчим аналогом [3] буферного розчину з рН (7,0-7,5). Середовище з таким рН запобігає вивільненню заліза з залізотранспортних протеїнів і, таким чином, дає можливість визначати саме лабільне залізо в плазмі крові. Тест-система, що заявляється, містить наступні інгредієнти: - буферний розчин з рН (7,0-7,5) (1 флакон - 100 мл); - буферний розчин з рН (4,5-5,0) (1 флакон - 100 мл); - кольорореагент (1 пробірка - 2 мл): феррозин (20±2) г/л; - калібрувальний розчин заліза (1 флакон - 8 мл) - (20±0.5) мкмоль/л; - насичуючий розчин заліза (1 флакон - 50 мл) - (90±10) мкмоль/л; - сорбент (1 флакон - 10 г): лужний карбонат магнію; - деіонізована вода (1 флакон – 8 мл). Тест-систему, що заявляється, апробовують у дослідах на щурах лінії Wistar масою 180-220 г. Тварин поділяють на дві групи: контрольну та дослідну. Тваринам дослідної групи на моделі рабдоміолізу [4] експериментально викликають патологічний стан, спричинений пошкодженням м'язів, що характеризується вивільненням у кров'яне русло вмісту м'язових клітин (електроліти, міоглобін та інші саркоплазматичні протеїни). Для цього дослідним тваринам у обидва стегнових м'яза разово вводять 50 %-й водний розчин гліцерину в дозі 10 мл/кг маси тіла. Кількісне визначення лабільного та загального заліза в плазмі крові проводять з використанням тест-системи, що заявляється. Оптичні показники розчинів визначають на спектрофотометрі "μQuant" (США). 60 1 UA 94397 U 5 10 15 20 Приклад 1. До двох зразків плазми крові по 0,25 мл кожен додають по 1 мл 0,2 М фосфатного буферного розчину з рН 7,4, який містить тіосечовину в концентрації 15 ммоль/л, гуанідину гідрохлорид - 4,7 ммоль/л, гідроксил аміну гідрохлорид - 76 ммоль/л. До контрольної проби додають 0,02 мл деіонізованої води, до дослідної проби додають 0,02 мл розчину ферозину концентрації 1,4 ммоль/л, витримують 15 хв при кімнатній температурі, при цьому в дослідній пробі утворюється стійке забарвлення фіолетового кольору. Далі фотометричним методом вимірюють величину оптичного поглинання дослідної проби проти контрольної проби при 562 нм і визначають max одержаного оптичного спектра поглинання комплексу ферозин-залізо (креслення). Так як величина оптичного поглинання дослідної проби пропорційна концентрації заліза в ній, за калібрувальною кривою залежності оптичного поглинання від вмісту заліза в плазмі крові визначають вміст лабільного заліза в дослідній пробі. Для калібрування використовують калібрувальний розчин заліза. Максимальне зростанню вмісту лабільного заліза в плазмі крові тварин, яке складає 2,6±0,6 мг/л, реєструють на 3 добу після ініціації рабдоміолізу, у контрольних тварин дана форма заліза відсутня (таблиця). Приклад 2. Кількісне визначення загального вмісту заліза в плазмі крові проводять стандартним методом [3] з використанням гліцин/НСІ буферного розчину з рН (4,5-5,0). В експерименті найвищий вміст загального заліза 3,5±0,7 мг/л реєструють на 3 добу після ініціації рабдоміолізу, вміст загального заліза в плазмі крові контрольної групи тварин складає 1,2±0,2 мг/л (таблиця). Таблиця Кількісний вміст лабільного та загального заліза в плазмі крові щурів нарізних термінах рабдоміолізу (n=6) Показники вмісту заліза, мг/л Лабільне залізо Загальне залізо Тривалість рабдоміолізу, діб 1 3 6 2,1±0,6 2,6±0,6 2,1±0,6 3,1±0,7* 3,5±0,7* 3,3±0,7* контроль 0 1,2±0,2 10 0,9±0,4 2,4±0,5* * - вірогідні зміни відносно контролю (p(t)