Тест-система імуноферментна для кількісного визначення фібриногену в плазмі крові людини

Реферат: Тест-система імуноферментна для кількісного визначення фібриногену в плазмі крові людини методом бісайтового твердофазного імуноферментного аналізу включає імуносорбент, кон'югат моноклональних антитіл із біотином, набір реагентів для імуноферментного аналізу. Імуносорбент і кон'югат моноклональних тіл із біотином виготовляють на основі власних моноклональних антитіл 2d-2a та II-4d. UA 70456 U (12) UA 70456 U UA 70456 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, імунохімії та медицини і може бути використана для кількісного визначення фібриногену в плазмі крові людини з діагностичною метою. Фібриноген є одним із важливих показників стану системи гемостазу. Під дією тромбіну фібриноген здатний перетворюватися на мономерний фібрин, який далі спонтанно полімеризується з утворенням нерозчинної тривимірної сітки, що слугує каркасом тромбів [1]. В процесі агрегації тромбоцитів молекули фібриногену виконують роль містків, які зв'язують клітини між собою [2]. Фібриноген є білком гострої фази, чутливим маркером запалення та некрозу тканин [3]. В нормі його концентрація в плазмі крові людини складає 2-4 г/л [4-5]. При запальних реакціях, травмах, опіках, післяопераційних станах, інфекційних хворобах концентрація фібриногену зростає в 2-10 і більше разів [6]. Кількість фібриногену також може збільшується при інсультах, інфарктах міокарда, гіпотиреозі, амілоїдозі, пневмонії та злоякісних пухлинах. Ріст концентрації фібриногену навіть у межах референсних значень, корелює зі збільшенням ризику ускладнень серцево-судинних хвороб. При нормальній вагітності вміст фібриногену може збільшуватися до 6 г/л. Знижений вміст фібриногену в плазмі крові може спостерігатися при ДВС-синдромі, захворюваннях печінки, токсикозі вагітних, емболії навколоплодними водами (у новонароджених), хронічному мієлолейкозі, недостачі вітамінів С і В12, поліцитемії, при застосуванні фібринолітичних препаратів та ін. [2]. У клінічній практиці фібриноген у плазмі крові визначають в основному за допомогою тестів, заснованих на наступних методах: 1) Метод визначення за Клаусом - визначення вмісту фібриногену за швидкістю утворення згустку при додаванні надлишку тромбіну до розведеної плазми. Основними недолікам даного методу є потреба в щоденному контролі реактивів та необхідність використання референтної плазми крові для побудови калібрувальної кривої, що значно ускладнює аналіз [7]. 2) Метод визначення за Рутбергом - визначення вмісту фібриногену ваговим методом є недостатньо стандартизованим та може давати недостовірні результати [8]. Дані методи є не досить точними, а, отже, тести, засновані на них, не можуть виявляти невелике збільшення концентрації фібриногену в динаміці, що, наприклад, може бути одним із показників розвитку ускладнень при серцево-судинних захворюваннях. Найточнішим методом визначення фібриногену в плазмі крові людини є імуноферментний аналіз, заснований на використанні специфічних та високоафінних до фібриногену моноклональних антитіл. Відома імуноферментна тест-система для визначення фібриногену в плазмі крові людини [9], в якій використані антитіла до фібриногену, що перехресно реагують з продуктами деградації фібрин(оген)у плазміном (ПДФ), присутніми в плазмі крові людини. Недоліком цієї імуноферментної тест-системи є те, що, незважаючи на розведення плазми в 100 разів, вміст ПДФ при деяких патологіях (ДВЗ-синдром) є настільки високим, що може впливати на одержані результати щодо кількісного визначення фібриногену. В основу корисної моделі, що заявляється, поставлена задача створити високочутливу та високоспецифічну імуноферментну тест-систему для визначення концентрації фібриногену в плазмі крові людини на основі компонентів вітчизняного виробництва. Поставлену задачу вирішують шляхом застосування власних, одержаних в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, моноклональних антитіл 2d-2a та II-4d, які взаємодіють із різними епітопами фібриногену людини [10-12]. Суть корисної моделі, що заявляється, полягає в створенні тест-системи імуноферментної на основі власних моноклональних антитіл 2d-2a, високоспецифічних та високоафінних до фібриногену людини [10, 11], в складі імуносорбенту. Епітоп для даних антитіл у молекулі фібриногену включає розщеплюваний тромбіном зв'язок Ββ14-15. Високе значення константи -9 дисоціації даних моноклональних антитіл (1,0410 ) дозволяє визначати з їх використанням концентрацію нативного фібриногену в плазмі крові, розведеній в 200 разів, причому концентрація фібрину desAA, з яким дані антитіла також здатні реагувати, знижується настільки, що чутливість методу не дозволяє його виявляти, а, отже, фібрин desAA не заважає визначенню концентрації нативного фібриногену [10, 11]. У складі кон'югату використовують біотинильовані моноклональні антитіла II-4d [12], епітоп для яких знаходиться в D-домені фібриногену. Принцип аналізу в тест-системі, що заявляється, базується на бісайтовому твердофазному імуноферментному аналізі з підсиленням сигналу за рахунок утворення комплексу біотин-стрептавідин-пероксидаза [12]. Приклад 1. Визначення кількості фібриногену в плазмі крові хворого А. з діагнозом аневризма черевної частини аорти до та після операції і при виписці. Визначення проводять згідно з методикою, заснованою на бісайтовому твердофазному імуноферментному аналізі [11, 13]. Для цього ліофілізований калібратор розчиняють в 220 мкл 1 UA 70456 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 розчину для розведення досліджуваних зразків. Після чого 100 мкл розведеного калібратора вносять до першої лунки 1-го ряду імуносорбенту та далі титрують його двократно до кінця ряду в об'ємі 100 мкл в розчині для розведення досліджуваних зразків. У лунки планшета для розведення зразків плазми вносять по 190 мкл розчину для розведення досліджуваних зразків та додають по 10 мкл зразків плазми хворих, добре перемішують та переносять 10 мкл в лунки імуносорбенту з 90 мкл розчину для розведення зразків (кожний досліджуваний зразок аналізують у двох повторах). Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при температурі 37 °C протягом 30 хв. Фібриноген зв'язується з моноклональними антитілами 2d-2a на твердій фазі утворюючи комплекс антиген-антитіло. Після відмивання планшету шість разів до лунок додають по 100 мкл біотинильованого кон'югату моноклональних антитіл II-4d, які взаємодіють із іншим епітопом фібриногену, та інкубують при температурі 37 °C протягом 15 хв. Після шестикратного відмивання до лунок додають по 100 мкл розчину стрептавідіну, міченого пероксидазою. Планшет інкубують при температурі 18-22 °C протягом 15 хв. Потім планшет відмивають шість разів, додають до лунок по 100 мкл розчину проявника (субстратний буфер із хромогеном) та інкубують при температурі 18-22 °C у темряві протягом 30 хв. Зупиняють кольорову реакцію, вносячи до всіх проб по 100 мкл стоп-реагенту. Не більше, як через 5 хв. після зупинки кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі (450 та 640 нм) за допомогою спектрофотометра. Кількість фібриногену в досліджуваному зразку плазми розраховують за калібрувальною кривою, при побудові якої на осі X відмічають концентрацію фібриногену в мкг/мл, а на осі Υ - відповідне їй значення ОГ, яке одержано в т-ІФА (креслення). Для розрахунку кількості фібриногену в мг/мл у досліджуваному зразку, значення концентрації фібриногену, яке отримують за калібрувальною кривою, множать на 200. На кресленні зображена калібрувальна крива для визначення концентрації фібриногену в плазмі крові людини. Досліджений матеріал від хворого А. містить фібриноген в концентрації: до операції - 3,4 мг/мл, після операції - 1,4 мг/мл, при виписці хворого - 4,3 мг/мл. Приклад 2. Визначення кількості фібриногену в плазмі крові хворого В. з тромбозом глибоких вен нижніх кінцівок і таза до операції та через 1 місяць після операції. Аналіз проводять аналогічно прикладу 1. Досліджений матеріал від хворого В. містить фібриноген в концентрації: до лікування - 1,8 мг/мл, після лікування 2,6 мг/мл через 1 місяць після лікування - 3,9 мг/мл. Приклад 3. Визначення кількості фібриногену в плазмі крові хворого С. з діагнозом артеріовенозна форма ангіодисплазії до та після операції. Аналіз проводять аналогічно прикладу 1. Досліджений матеріал від хворого С. містить фібриноген в концентрації: до операції - 5,2 мг/мл, після операції - 2,6 мг/мл. Приклад 4. Визначення кількості фібриногену в 60 зразках плазми крові здорових донорів. Аналіз проводять аналогічно прикладу 1. Кількість фібриногену в дослідженому матеріалі від здорових донорів не перевищує значень норми і складає 2,0-3,5 мг/мл. Перевагами тест-системи імуноферментної, що заявляється, є: - використання високоспецифічних та високоафінних до фібриногену моноклональних антитіл 2d-2a власного виробництва; - використання в складі кон'югату моноклональних антитіл із біотином високоафінних до фібриногену моноклональних антитіл II-4d власного виробництва, які не конкурують із моноклональними антитілами 2d-2a за місце зв'язування на молекулі фібриногену; - точне кількісне визначенняфібриногену в присутності інших білків плазми крові; - висока чутливість бісайтового т-ІФА методу визначення фібриногену в плазмі крові людини при використанні тест-системи імуноферментної, що заявляється; - автоматичне кількісне визначення фібриногену; - стабільність імуносорбенту при зберіганні; - швидке виконання аналізу (близько 2 год.); - простота і надійність в роботі. Таким чином, пропонована тест-система імуноферментна забезпечує швидке визначення в плазмі крові концентрації однієї з провідних ланок системи зсідання крові - фібриногену, що має суттєве значення для діагностики стану системи гемостазу. Тест-система проста і надійна в роботі, проявляє високі чутливість та специфічність. Джерела інформації: 2 UA 70456 U 5 10 15 20 25 30 35 40 1. Луговской Э.В. Молекулярные механизмы образования фибрина и фибринолиза / К.: 2003.-220 с. 2. Bennett J. S. Platelet-fibrinogen interaction / Ann. Ν. Υ. Acad. Sci.-2001.-936. - P. 340-354. 3. Зубаиров Д.М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования. - Казань: ФЭН.-2000.-367 с. 4. Blomback В. Fibrinogen and fibrin formation // Plasma proteins. - New York, Brisbane, Toronto.Edited by B. Blomback, L. Α., Hanson. - John Wiley & Sons. Chichester.-1979. - P. 223-253. 5. Pilgeram L. Control of Fibrinogen Biosynthesis: Role of the FFA /Albumin Ratio / Cardiovasc. Eng.-2010, Apr 10. [Epub ahead of print]. 6. Gabay C, Kushner I. Acute-phase protein and other systemic responses to inflammation / New. Engl. J. Med.-1999.-340. - P. 448-454. 7. Pat. CN 101221184. 2008-07-16. 8. Современные представления о системе гемостаза / Г.Л. Волков, Т.Н. Платонова, А.Н. Савчук. - К.: Наукова думка, 2005.-296 с. 9. Определение фибриногена и ПДФ с использованием иммуноферментной тест-системы / Тромбоз, гемостаз и реология. - http://www.hemostas.ru/society/publications/m10.shtml#test. 10. Lugovskoi E. V., Makogonenko E. M., Chudnovets V. S., Derzskaya S. G., Gogolinsikaja G. K., Kolesnikova I. N., Bukhanevich A. M., Komisarenko S. V. The study of fibrin polymerization with monoclonal antibodies / Biomedical science.-1991.-2. - P. 249-296. 11. Пат. UА 73233. 15.06.2005, Бюл. № 6. 12. Пат. UA 73232. 15.06.2005, Бюл. № 6. 13. Співак М.Я., Іванська Н.В. Практичний посібник з імуноферментного аналізу. - К.: Полімед.-2003.-48 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 1. Тест-система імуноферментна для кількісного визначення фібриногену в плазмі крові людини методом бісайтового твердофазного імуноферментного аналізу, що включає імуносорбент, кон'югат моноклональних антитіл із біотином, набір реагентів для імуноферментного аналізу, яка відрізняється тим, що імуносорбент і кон'югат моноклональних тіл із біотином виготовляють на основі власних моноклональних антитіл 2d-2a та II-4d. 2. Тест-система за п. 1, яка відрізняється тим, що моноклональні антитіла 2d-2a, які входять до складу імуносорбенту, з високою специфічністю та високою афінністю реагують із фібриногеном людини. 3. Тест-система за п. 1, яка відрізняється тим, що до складу кон'югату моноклональних антитіл із біотином входять високоафінні до фібриногену моноклональні антитіла II-4d, які не конкурують із моноклональними антитілами 2d-2a за місце зв'язування на молекулі фібриногену. 4. Тест-система за п. 2, яка відрізняється тим, що висока афінність моноклональних антитіл 2d-2a, які використовуються в складі імуносорбенту, дозволяє проводити точне кількісне визначення концентрації фібриногену в присутності інших білків плазми крові, розведеної в 200 разів. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3