Тест-система імуноферментна для кількісного визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини

Реферат: Тест-система імуноферментна для кількісного визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини методом бісайтового твердофазного імуноферментного аналізу, що включає імуносорбент, кон'югат моноклональних антитіл із біотином, набір реагентів для імуноферментного аналізу. Імуносорбент і кон'югат із біотином виготовляють на основі власних моноклональних антитіл FnI-3С та II-4d. UA 69283 U (12) UA 69283 U UA 69283 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнології, імунохімії та медицини і може бути використана для визначення концентрації розчинного фібрину в плазмі крові людини методом бісайтового твердофазного імуноферментного аналізу (т-ІФА) з метою своєчасної діагностики загрози тромбоутворення, дисимінованого внутрішньосудинного зсідання крові (ДВЗ-синдрому) та моніторингу антитромботичної терапії [1]. Багато тяжких захворювань людини, таких як інфаркт міокарда, ішемічний інсульт, ДВЗсиндром, тромбоз глибоких вен, тромбоемболія легеневої артерії, діабет, онкологія та інші пов'язані з надмірною активацією системи зсідання крові, яка призводить до внутрішньосудинного тромбоутворення. Центральним білком системи зсідання крові є фібриноген, який при активації системи зсідання під впливом тромбіну перетворюється на фібрин, здатний полімеризуватися з утворенням різних форм розчинного фібрину. Підвищений вміст цього молекулярного маркера може свідчити про загрозу тромбоутворення та необхідність антитромботичної терапії [2]. У здорових донорів віком 18-22 років концентрація розчинного фібрину в плазмі крові варіює в діапазоні 0,01-3 мкг/мл і з віком може підвищуватися. Кількісне визначення розчинного фібрину має найбільше значення для діагностики передтромботичних станів, ДВЗ-синдрому та моніторингу антитромботичної терапії. Передтромботичні стани можуть спостерігатися при ішемічній хворобі серця, цукровому діабеті, онкологічних захворюваннях, після хірургічних втручань, при ускладненій вагітності та при інших патологіях [1]. У клінічній практиці розчинний фібрин у плазмі крові визначають за допомогою тестів, заснованих на наступних методах [3]: 1) преципітація різними хімічними агентами (ортофенантроліном, протамінсульфатом, нафтолом, етанолом, фосфатами калію і натрію); 2) функціональні методи, засновані на здатності розчинного фібрину прискорювати перетворення плазміногену на плазмін під дією тканинного активатора плазміногену; 3) імунохімічні методи з використанням фібринспецифічних антитіл. Однак перші два існуючих методи та відповідні тест-системи мають суттєві недоліки [4]. Методи, що відносяться до першої і другої груп, є напівкількісними. Визначення розчинного фібрину за допомогою тестів, заснованих на цих методах, є досить неточним, для них часто характерна суб'єктивна візуальна оцінка одержуваних результатів, що призводить до значних похибок при вимірюваннях. До того ж, за допомогою таких тестів неможливо виявити невелике зростання концентрації розчинного фібрину в динаміці, що є дуже важливим для виявлення загрози тромбоутворення в хворих на серцево-судинні та інші захворювання. Існуючі зарубіжні імунохімічні тест-системи для визначення розчинного фібрину є більш прийнятними для визначення даного молекулярного маркера, ніж напівкількісні методи, оскільки мають давати більш точну кількісну інформацію. Але деякі з таких тест-систем потребують попередньої обробки досліджуваної плазми крові додатковими хімічними агентами, що уповільнює та ускладнює процес аналізу [5]. Більше того, існує складність в інтерпретації результатів у зв'язку з різною специфічністю антитіл, що використовуються у складі імуносорбенту. Обмежена кількість таких тест-систем зумовлена вкрай малою кількістю фібринспецифічних моноклональних антитіл в світовій науковій практиці та ще меншою кількістю таких антитіл, придатних для використання в тест-системах, адаптованих для промислового виробництва. В Україні та в країнах СНД відсутні вітчизняні імуноферментні тест-ситеми для кількісного визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини. Закордонні імуноферментні тестсистеми не використовуються в Україні через свою високу вартість. Відомо тест-систему, вибрану як найближчий аналог, створену на основі моноклональних антитіл МН1 для визначення in vitro наявності або кількості розчинних поперечно прошитих (стабілізованих фактором ХІІІа) та розчинних поперечно непрошитих (нестабілізованих) полімерів фібрину desAABB у зразках плазми крові, як заявлено для визначення схильності до передтромботичних станів [6]. Моноклональні антитіла МН1, що використані в цій тест-системі, реагують з полімерним та олігомерним фібрином desAABB, стабілізованим та нестабілізованим за допомогою фактора ХІІІа, та не реагують із фібриногеном і продуктами деградації фібрину й фібриногену. Але ці моноклональні антитіла не реагують також з комплексом фібрин desAA фібриноген і з мономерами та олігомерами фібрину desAA, які й є основними компонентами розчинного фібрину. Тому дана тест-система, не може бути використана для визначення концентрації інтактного розчинного фібрину в плазмі крові та ранньої діагностики передтромботичних станів. 1 UA 69283 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В основу корисної моделі, що заявляється, поставлено задачу створити високочутливу та специфічну імуноферментну тест-систему для кількісного визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини на основі компонентів вітчизняного виробництва. Поставлену задачу вирішують шляхом застосування одержаних в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України моноклональних антитіл FnI-3С та II-4d, що взаємодіють з різними епітопами фібрину людини [7, 8]. Суть корисної моделі, що заявляється, полягає в створенні тест-системи імуноферментної на основі одержаних в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України моноклональних антитіл FnI-3С, специфічних до фібрину людини [7], в складі імуносорбенту. Моноклональні антитіла FnI-3С з високою специфічністю та афінністю реагують з фібрином desAA і desAABB людини та не реагують із фібриногеном та продуктами гідролізу фібриногену й фібрину плазміном, за виключенням Х-фрагмента фібрину, що забезпечує високу специфічність реакції [8, 9, 10]. В складі кон'югату використовують біотинильовані моноклональні антитіла II-4d [8], епітоп для яких знаходиться в D-домені фібрин(оген)у. Перехресна реакція моноклональних антитіл II-4d з фібриногеном не заважає визначенню розчинного фібрину в досліджуваній плазмі крові людини, оскільки з імуносорбентом фібриноген не зв'язується. Принцип аналізу в тест-системі, що заявляється, базується на бісайтовому т-ІФА з підсиленням сигналу за рахунок утворення комплексу біотин-стрептавідин-пероксидаза [11-12]. Приклад 1 Визначення кількості розчинного фібрину в плазмі крові хворого А. з геморагічними ускладненнями до та після операції, а також на третю добу після операції. Визначення проводять згідно з методикою, заснованою на т-ІФА [13, 14]. Ліофілізований калібратор розчиняють в 200 мкл розчину для розведення калібратора та додають 1,8 мл розчину для розведення досліджуваних зразків. Після чого 100 мкл розведеного калібратора вносять в першу лунку 1-го ряду планшета з іммобілізованими специфічними до фібрину моноклональними антитілами (імуносорбенту) та далі титрують його двократно до кінця ряду в об'ємі 100 мкл у розчині для розведення досліджуваних зразків. У лунку з 90 мкл розчину для розведення досліджуваних зразків додають 10 мкл зразка плазми крові хворого (досліджуваний зразок аналізують у двох повторах). Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при температурі 37 °C протягом 30 хв. Після шестикратного відмивання планшета в лунки додають по 100 мкл кон'югата (біотинильовані моноклональні антитіла), що реагує з фібрином людини, та інкубують при температурі 37 °C протягом 15 хв. Після шестикратного відмивання планшета в лунки додають по 100 мкл розчину стрептавідину, міченого пероксидазою. Планшет інкубують при температурі 18-22 °C протягом 15 хв. Потім планшет відмивають шість разів, додають у лунки по 100 мкл розчину проявника (з субстратом та хромогеном) та інкубують при температурі 18-22 °C у темряві протягом 30 хв. Зупиняють кольорову реакцію, вносячи до всіх проб по 100 мкл стоп-реагенту. Не пізніше, як через 5 хв після зупинки кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі (450-640 нм) за допомогою спектрофотометра. Результат кількісного аналізу розчинного фібрину в досліджуваному зразку плазми розраховують за калібрувальним графіком, при побудові якого на осі X відмічають концентрації розчинного фібрину в мкг/мл, а на осі Y відповідні їм значення ОГ, які отримано в ІФА (графік). Для розрахунку кількості розчинного фібрину в мкг/мл у досліджуваному зразку значення концентрації розчинного фібрину, отриманого за калібрувальним графіком, множать на 10. Досліджений матеріал від хворого А. містить розчинний фібрин у концентраціях: до операції - 77,1 мкг/мл, після операції - 71,9 мкг/мл, через 3 доби після операції - 17,8 мкг/мл. Приклад 2 Визначення кількості розчинного фібрину в зразках плазми крові здорових донорів. Аналіз проводять аналогічно прикладу 1. Кількість розчинного фібрину в дослідженому матеріалі від здорових донорів не перевищує значень норми й складає до 3 мкг/мл. Перевагами тест-системи імуноферментної, що заявляється, є: - використання високоспецифічних до розчинного фібрину моноклональних антитіл FnI-3С власного виробництва; - висока чутливість бісайтового т-ІФА методу визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини з використанням тест-системи, що заявляється; - автоматичне кількісне визначення розчинного фібрину; - стабільність імуносорбента при зберіганні; - швидке виконання аналізу; - простота та надійність в роботі. 2 UA 69283 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Таким чином, тест-система, що заявляється, забезпечує швидке визначення в плазмі крові людини наявності та кількості розчинного фібрину - одного з основних молекулярних маркерів активації системи зсідання крові та загрози тромбоутворення, що, разом з одночасним кількісним визначенням D-димеру, має важливе значення для своєчасної діагностики передтромботичних станів, дисимінованого внутрішньосудинного зсідання крові та моніторингу ефективності антитромботичної терапії. Тест-система проста та надійна в роботі, проявляє високу чутливість та специфічність. Джерела інформації: 1. Dempfle C.E. The use of soluble fibrin in evaluating the acute and chronic hypercoagulable state // Thromb. Haemost.-1999. - Vol. 82, N 2. - P. 673-683. 2. Луговской Э.В. Молекулярные механизмы образования фибрина и фибринолиза. - К.: Наукова думка.-2003. - 220 с. 3. Dempfle C.E., Zips S., Ergul H., Heene D.L. The fibrin assay comparison trial (FACT): correlation of soluble fibrin assays with D-dimer // Thromb. Haemost.-2001. - Vol. 86, N 5. - P. 12041209. 4. Розчинний фібрин. Молекулярна структура і кількісне визначення / Е.В. Луговськой, П.Г. Гриценко, Н.Е. Луговська, І.Н. Колеснікова, С.В. Комісаренко // Лабораторна діагностика.-2006. 3, № 37. - с. 11-17. 5. Lill Н., Spannagl М., Trauner A., Schramm W., Schuller D., Ofenloch-Haehnle В., Drager В., Naser W., Dessauer A. A new immunoassay for soluble fibrin enables a more sensitive detection of the activation state of blood coagulation in vivo // Blood Coagulation and fibrinolysis.-1993. - Vol. 4, P. 97-102. 6. Pat. US 5,843,690. - December 1, 1998. 7. Пат. 87375 UA. - Опубл. 10.07.09, Бюл. № 13. 8. Пат. 73232 UA. - Опубл. 15.06.2005, Бюл. № 6. 9. Пат. 87375 UA. - Опубл. 10.07.09, Бюл. № 13. 10. Пат. 73232 UA. - Опубл. 15.06.2005, Бюл. № 6. 11. A neoantigenic determinant in coiled coil region of human fibrin -chain / E.V. Lugovskoy, P.G. Gritsenko, I.N. Kolesnikova, N.E. Lugovskaya, S.V. Komisarenko // Thromb. Res.-2009. - V. 123. - P. 765-770. 12. Луговська Н.Е. Виявлення неоантигенної детермінанти в молекулі фібрину та встановлення її функціональної ролі: автореф. дис. на здобуття наук, ступеня канд. біол. наук: спец. 03.00.04 "Біохімія" / Н.Е. Луговська. - К., 2010. - 21 с. 13. Співак М.Я. Практичний посібник з імуноферментного - К.: Полімед.-2003. - 48 с. 14. Растворимый фибрин и D-димер при нормально протекающей беременности и при угрозе еѐ прерывания / Э.В. Луговской, И.Н. Колесникова, Н.Э. Луговская, П.Г. Гриценко, Л.М. Литвинова, Г.К. Гоголинская, Е.Д. Ляшко, Е.П. Костюченко, В.Я. Голота, В.В. Курочка, С.В. Комисаренко // Укр. биохим. журн.-2006.-78, № 4. - с. 120-129. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 1. Тест-система імуноферментна для кількісного визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини методом бісайтового твердофазного імуноферментного аналізу, що включає імуносорбент, кон'югат моноклональних антитіл із біотином, набір реагентів для імуноферментного аналізу, яка відрізняється тим, що імуносорбент і кон'югат із біотином виготовляють на основі власних моноклональних антитіл FnI-3С та II-4d. 2. Тест-система імуноферментна за п. 1, яка відрізняється тим, що моноклональні антитіла FnI-3С, які входять до складу імуносорбенту, з високою специфічністю та афінністю реагують із фібрином desAA і desAABB людини без перехресної реакції з фібриногеном і продуктами гідролізу фібрин(оген)у плазміном, за виключенням X-фрагмента фібрина. 3. Тест-система імуноферментна за п. 1, яка відрізняється тим, що до складу кон'югата моноклональних антитіл із біотином входять високоафінні до фібрину моноклональні антитіла II4d, які не конкурують із моноклональними антитілами FnI-3С за місце зв'язування на антигені. 3 UA 69283 U Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4