Тест-система для визначення плазміногену в плазмі крові

Реферат: UA 104060 C2 (12) UA 104060 C2 Винахід належить до галузі біохімії та може використовуватися в лабораторній діагностиці для аналізу крові при порушеннях системи гемостазу. Тест-система містить плазму крові людини, стрептокіназу, концентрат буферного розчину, фібрин-мономер бика (ліофільно висушений або розчин), а визначення плазміногену проводять шляхом визначення часу напівлізису згустку фібрину, за яким розраховують швидкість лізису згустку фібрину та визначають концентрацію плазміногену в плазмі крові за калібрувальною кривою залежності швидкості лізису фібринового згустку від концентрації плазміногену. UA 104060 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Винахід належить до галузі біохімії та може використовуватися в лабораторній діагностиці для аналізу крові при порушеннях системи гемостазу. При багатьох захворюваннях відбувається порушення балансу між системами зсідання та фібринолізу, що вимагає контролю в плазмі крові рівня компонентів цих систем, зокрема плазміногену. Плазміноген, центральний білок фібринолітичної системи, є проферментом серинової ендопептидази плазміну, який утворюється в крові під дією активаторів. In vivo активація плазміногену тканинним активатором відбувається безпосередньо на фібриновому згустку, з яким зв'язуються профермент та його активатор. В нормі вільний плазмін в крові не існує, оскільки швидко та необоротно інактивується інгібіторами, в першу чергу α 2антиплазміном [1]. Зниження фібринолітичного потенціалу плазми крові є одним із факторів ризику тромбоутворення. У пацієнтів із тромбозами зафіксовано зниження рівня плазміногену та його активаторів із одночасним підвищенням концентрації інгібіторів фібринолізу. Гіпоплазміногенемія спостерігається при ДВЗ синдромі, онкологічних захворюваннях, еклампсії, тромболітичній терапії чи порушеннях синтезу плазміногену при певних захворюваннях печінки [2-4]. Надмірна активація фібринолітичної системи внаслідок надходження у кровотік надлишкової кількості тканинного активатора або у відповідь на внутрішньосудинне тромбоутворення супроводжується гіперплазмінемією, гідролізом фібриногену та інших факторів зсідання крові, і призводить до геморагій [5]. Сьогодні в медичній практиці для дослідження системи гемостазу в нормі та при різноманітних патологіях застосовують тест-системи для визначення плазміногену, в основі яких лежать різні принципи та методологічні підходи: спонтанний еуглобуліновий лізис, стимульований еуглобуліновий лізис, лізис хромогенних субстратів, гідроліз казеїну, імуноферментний аналіз, лізис фібринового згустку [3, 6-11]. Суттєвими недоліками цих тест-систем є візуальна реєстрація результатів, визначення концентрації проферменту, а не його функціональної активності, одержання завищених показників, довга тривалість виконання аналізу, трудомісткість та висока вартість. Найбільш близьким до винаходу, що заявляється, за технічною суттю і результатом, що досягається, є тест-система для визначення плазміногену ("Фибринолиз-тест"), до складу якої входить контрольна плазма, концентрат буферного розчину, каолін, хлорид кальцію, тромбін, стрептокіназа та інші витратні матеріали [12]. За допомогою цієї тест-системи визначають плазміноген за часом лізису згустку, індукованого стрептокіназою, який одержують при зсіданні еуглобулінової фракції плазми крові тромбіном. Недоліком цієї тест-системи є візуальна реєстрація результатів, тривалий час проведення аналізу, використання дорогих реактивів та витратних матеріалів, крім того, на результати визначення плазміногену впливають концентрації фібриногену в хворих (гіперфібриногенемія сприяє подовженню часу лізису, гіпофібриногенемія - його скороченню. Задачею винаходу, що заявляється, є розробка тест-системи для високочутливого, простого у виконанні, автоматичного та економного визначення плазміногену в плазмі крові. Поставлену задачу вирішують шляхом створення оптимального складу тест-системи для визначення плазміногену за часом напівлізису фібринового згустку плазміногеном, активованим стрептокіназою, з використанням турбідиметричного методу та автоматичною реєстрацією часу напівлізису фібрин-мономеру, одержаного з фібриногену бика, у відсутності каоліну. В основі розробленої тест-системи лежить спосіб визначення плазміногену в плазмі крові [13], за яким реєструють зміни світлорозсіювання в процесі полімеризації та гідролізу фібрину при довжині хвилі 350 нм за схемою: Активація Вимірювання Плазміноген + СК*  Плазміноген – СК - комплекс Плазміноген - СК* - комплекс + фібрин → Е350 СК*- стрептокіназа. 50 55 При внесенні фібрин-мономеру в нейтральне середовище відбувається його швидка полімеризація через утворення протофібрил без зміни оптичної густини середовища з наступною латеральною агрегацією протофібрил, яка супроводжується приростом оптичної густини при 350 нм. У присутності в цій системі плазміну або активованого плазміногену відбувається лізис фібринового згустку, при цьому оптична густина зменшується. Із застосуванням турбідиметричного методу реєструють час напівлізису - проміжок часу від моменту початку утворення фібринового згустку до моменту зменшення на 50 % його 1 UA 104060 C2 5 10 15 20 25 30 35 максимальної оптичної густини при 350 нм (t/2) та розраховують швидкість лізису фібринового згустку - величину, зворотну часу напівлізису згустку (l/t/ 2). Відлік часу напівлізису фібринового згустку починають з моменту внесення в реакційне середовище фібрин-мономеру. Зміни світлорозсіювання реєструють автоматично. Тест-система, що заявляється, містить: бідну на тромбоцити плазму крові людини (заморожену або ліофільно висушену) з відомим вмістом плазміногену (плазма - калібратор); ліофільно висушену стрептокіназу 1500 ME; буферний розчин трис-НСІ 1М (концентрат); фібрин-мономер бика (ліофільно висушений або розчин); фізіологічний субстрат. Визначення плазміногену з використанням тест-системи, що заявляється, проводять, виконуючи наступні дії: а) заморожену плазму - калібратор крові людини - розморожують на водяній бані при температурі 37 °C протягом 30 хв, ліофільно висушену розчиняють у воді протягом 20 хв.; б) стрептокіназу розчиняють у воді (робочий розчин - 750 МО/мл); в) концентрат буферного розчину розводять у співвідношенні 1:20 водою; г) ліофільно висушений фібрин-мономер бика розчиняють у суміші вода:оцтова кислота (799:1), розчин фібрин-мономеру розводять до концентрації 10 мг/мл; д) визначення плазміногену проводять, як описано в [13]: Для визначення рівня плазміногену в досліджуваних плазмах крові групи донорів, в термостатовану кювету вносять по 20 мкл плазми крові, 20 мкл робочого розчину стрептокінази (15 МО), 940 мкл буферного розчину і 20 мкл розчину фібрин-мономеру. Для побудови калібрувальної кривої у термостатовану кювету при температурі 37 °C вносять від 7 до 28 мкл плазми - калібратора, що містить від 1 до 4 мкг плазміногену, стрептокіназу з розрахунку 5 МО на 1 мкг плазміногену та буферний розчин. Утворення фібринового згустку ініціюють внесенням у реакційну суміш 20 мкл 1 %-го розчину фібрин-мономеру. Загальний об'єм реакційної суміші складає 1 мл. Реєструють максимальне значення оптичної густини реакційної суміші при довжині хвилі 350 нм та час його зниження на 50 % (t1/2, с) і розраховують швидкість лізису -1 фібринового згустку (1/t1/2, с ). Будують калібрувальну криву залежності швидкості лізису згустку фібрину від концентрації плазміногену (фіг.1). За калібрувальною кривою знаходять концентрацію плазміногену в досліджуваній плазмі крові, використовуючи розрахункову формулу: Пг = Р х 50, де: Пг - концентрація плазміногену, мкг/мл; Р - кількість плазміногену, визначена за калібрувальною кривою в 1 мл реакційної суміші, мкг/мл; 50 - коефіцієнт перерахунку на 1 мл плазми крові. Результати визначення плазміногену в плазмі крові наведені в табл. 40 Таблиця Вміст плазміногену в досліджуваних зразках плазми крові донорів (М±m, n=5) № зразка 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 45 Вміст плазміногену, мкг/мл М±m 145±5,08 135±6,75 180±7,20 125±2,50 166±7,30 200±8,30 178±6,66 153±3,20 194±5,10 134±4,10 Отримані дані свідчать про високу точність та відтворюваність результатів визначення вмісту плазміногену в плазмі крові людини. Таким чином, тест-система для визначення плазміногену в плазмі крові, що заявляється, має переваги перед найближчим аналогом, а саме: 2 UA 104060 C2 5 10 15 20 25 30 35 дозволяє автоматично з високою точністю та відтворюваністю визначити час напівлізису фібринового згустку, за допомогою якого визначають плазміноген; використовує як джерело фізіологічного субстрату фібрин-мономер бика без домішок плазміногену; на результати визначення плазміногену в плазмі крові не впливають концентрації фібриногену в досліджуваних зразках; процес визначення плазміногену потребує менше технологічних операцій, а, отже, й часу; має доступну вартість; не має вітчизняних аналогів. Джерела інформації: 1. Castellino F.I., Powell J.R. // Meth. Enzymol.-1981. - vol. 80. - p. 365-378. 2. Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. - М.: Ньюдиамед. - 2001. - 285 с. 3. Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. - М. - Тверь: ООО Издательство "Триада". - 2005. - 227 с. 4. Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. М.: Медицина. - 2006. - 544 с. 5. Carrel R.,Boswell D. Proteinase inhibitors. Eds by Barrett A., Salvesen G.Elsevier. Amsterdam-1986. - p. 403-420. 6. Титаева Е.В., Добровольский А.Б, Титов В.Н. Турбидиметрический метод определения плазминогена. - Лабораторное дело. - 1991. - №1. - С. 32-35. 7. Хромо-Тех-плазминоген, тест-набор, ООО Фирма "Технология-Стандарт", кат. № 092, РФ. 8. Реахром-плазминоген, тест-набор, НПО РЕНАМ, кат. ФА-2, РФ. 9. ЗАО "Лабораторная диагностика", Plasminogen Hemosil, кат. № 2009000. 10. TriniCHROM Plasminogen (Tcoag, Ирландия), ТВ Т2605. 11. Пат. РФ 2189590, 20.09.2002. 12. Фибринолиз-тест, Ольвекс-диагностикум, кат. №009, РФ. 13. Пат. № 65219 UA, 25.11.2011. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Тест-система для визначення плазміногену в плазмі крові, що містить плазму крові людини, стрептокіназу, концентрат буферного розчину, яка відрізняється тим, що додатково містить фібрин-мономер бика (ліофільно висушений або розчин), а визначення плазміногену проводять шляхом визначення часу напівлізису згустку фібрину, за яким розраховують швидкість лізису згустку фібрину та визначають концентрацію плазміногену в плазмі крові за калібрувальною кривою залежності швидкості лізису фібринового згустку від концентрації плазміногену. 3 UA 104060 C2 Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4