Спосіб одержання засобу з протизапальною, анальгетичною та діуретичною активністю

1. Спосіб одержання засобу з протизапальною, анальгетичною та діуретичною активністю, що включає неодноразову екстракцію рослинної сировини спиртом етиловим при загальному співвідношенні сировини до екстрагенту як 1:9 - 1:11, об'єднання одержаних екстрактів та їх упарювання, який відрізняється тим, що екстракції піддають листя тополі китайської 49-51 % спиртом етиловим при температурі 60-80 °С послідовно тричі по 2 години, а об'єднаний екстракт додатково відстоюють, фільтрують і концентрують до одержання сухого залишку. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що об'єднаний екстракт відстоюють при температурі від +5 °С до +10 °С протягом 24-48 годин. UA (21) a201006277 (22) 25.05.2010 (24) 10.08.2011 (46) 10.08.2011, Бюл.№ 15, 2011 р. (72) РУДНИК АННА МИХАЙЛІВНА, КРАВЧЕНКО ВІРА МИКОЛАЇВНА, КОВАЛЬОВ ВОЛОДИМИР МИКОЛАЙОВИЧ, БОРОДІНА НАТАЛІЯ ВАЛЕРІЇВНА, ДЕНИС АНТОНІНА ІГОРІВНА, ГРОШОВИЙ ТАРАС АНДРІЙОВИЧ (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ (56) UA A 8568, 01.01.2005. UA C2 73209, 25.06.2005. RU C1 2104709, 20.02.1998. RU C1 2179577, 20.02.2002. RU C1 2322501, 20.04.2008. RU C1 2135201, 20.04.1998. C2 2 (19) 1 3 95567 листя груші [3], який включає екстракцію сировини 10 спиртом етиловим при співвідношенні сировина : екстрагент (1: 9) - (1:11) протягом 9-11 годин, упарювання одержаного екстракту до 1/18 - 1/20 попереднього об'єму. Згідно з відомим способом сировину піддають екстракції 5-7 разів новими порціями екстрагенту, а одержані екстракти об'єднують. Сухий залишок - 24,3 %. Проте, зазначений спосіб не дозволяє одержати засіб, що проявляє додаткову аналгетичну дію, доречну при лікуванні запальних процесів сечовидільної системи. Задача винаходу полягає у створенні способу одержання засобу рослинного походження з комплексною протизапальною, аналгетичною та діуретичною активністю шляхом водно-спиртової екстракції листя тополі китайської при заданих параметрах способу, що дозволяє скоротити час проведення процесу, підвищити вихід і розширити спектр специфічної активності продукту. Поставлена задача вирішується таким чином, що у способі одержання засобу з протизапальною, аналгетичною, діуретичною активністю, що включає неодноразову екстракцію рослинної сировини спиртом етиловим при загальному співвідношенні сировини до екстрагенту 1:9-1:11, об'єднання одержаних екстрактів та їх упарювання, у відповідності з винаходом екстракції піддають листя тополі китайської 49-51 % спиртом етиловим при температурі 60 - 80°С послідовно тричі по 2 години новими порціями екстрагента, об'єднаний екстракт 4 додатково відстоюють, фільтрують і концентрують до одержання сухого залишку. Винаходом передбачено, що об'єднаний екстракт відстоюють при температурі від +5 °С до +10 °С протягом 24-48 годин. Всі параметри заявленого способу визначені експериментальним шляхом. Сукупність ознак способу є новою, не відомою з джерел інформації. Тополя китайська (Populus Simonii Carr.) поширена на території України, як декоративна рослина [4]. З літературних джерел не відомо використання тополі китайської з лікувальною метою, хоча листя та бруньки інших видів тополь (тополі чорної, тополі тремтячої) використовують як у народній так і у офіційній медицині. Авторами вперше було досліджено фармакологічну активність листя тополі китайської, що дає можливість розширити перелік засобів рослинного походження з протизапальною, аналгетичною та діуретичною активністю. Вибір 49-51 % спирту етилового як екстрагенту обумовлений його здатністю найбільш повно вилучити з листя тополі китайської комплексу біологічно активних речовин (БАР) з заданим спектром фармакологічної активності. При здійсненні серії експериментів з визначення концентрації екстрагенту було встановлено, що вичерпна екстракція комплексу БАР забезпечується 49-51 % етанолом. Дані експерименту наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Кількісний вихід екстрактивних речовин з листя тополі китайської при використанні різних екстрагентів Екстрагент Кількісний вихід екстрактивних речовин, % вода 20 % етанол 50 % етанол 70 % етанол 96 % етанол 34,49 35,82 36,98 36,80 30,06 Визначені експериментальним шляхом такі ознаки, як співвідношення сировина : екстрагент 1:9 - 1:11, тривалість екстракції протягом 2 годин при нагріванні до 60-80 °С з двократною заміною екстрагенту дозволяє максимально вилучити БАР з комплексною протизапальною, аналгетичною та діуретичною активністю з сировини при найменшій витраті часу і забезпечити високий вихід сухого екстракту на рівні 32 %. Очищення об'єднаного екстракту здійснюється його відстоюванням при температурі від +5 °С до +10 °С протягом 24-48 годин., що призводить до осадження частинок сировини та відокремленням осаду шляхом фільтрування. Концентрування одержаного екстракту доцільно здійснювати шляхом упарювання під вакуумом. Для упарювання екстракту оптимальним є інтервал температур 60-70 °С, який обумовлений концентрацією етанолу в екстрагенті. При зменшенні температури збільшується час упарювання, при збільшенні можливе руйнування термолабільних речовин. Експериментально був здійснений вибір сировини в залежності від фази вегетації тополі китайської. Результати дослідження динаміки накопичення фенольних сполук у листі тополі китайської у різні терміни заготівлі наведені у табл. 2. Таблиця 2 Кількісний вміст фенольних сполук у листі тополі китайської в залежності від фази вегетації. Група БАР Гідроксикоричні кислоти, % Флавоноїди, % Дубильні речовини, % Травень Червень Липень Серпень Вересень Жовтень 3,97 3,62 3,23 2,93 2,88 2,73 2,07 4,99 1,84 4,63 1,46 4,15 0,94 3,32 2,05 4,92 1,6 4,56 5 95567 Дані табл. 2 свідчать, що найбільша кількість фенольних сполук у листі тополі китайської накопичуються у травні, тому для одержання з листя тополі китайської комплексу БАР з протизапальною, аналгетичною та діуретичною активністю раціонально використовувати сировину, заготовлену саме у травні. Заявлений спосіб здійснюють таким чином. Повітряно-сухе листя тополі китайської екстрагують 49-51 % етанолом, при співвідношенні сировина : екстрагент 1:9 - 1:11, тричі протягом 2 годин, при нагріванні до 60-80 °С. Об'єднаний екстракт відстоюють при температурі (+5 °С) - (+10 °С) протягом 24-48 годин, фільтрують та концентрують переважно шляхом упарювання під вакуумом при температурі 60-70 °С до одержання сухого залишку. Одержаний сухий екстракт листя тополі китайської гігроскопічний порошок гірчичнозеленуватого кольору, зі специфічним запахом, гіркий на смак, добре розчинний у 40-80 % спирті та киплячій воді, практично нерозчинний в ефірі, хлороформі. Вихід продукту 32 %. Винахід ілюструється прикладами. Приклад 1. 1,5 кг подрібненого повітряносухого листя тополі китайської поміщають у реактор з підігрівом, заливають 50 % етанолом та екстрагують при температурі 70 °С протягом 2 годин при періодичному перемішуванні. Другу екстракцію проводять за попередніх умов. Загальне співвідношення сировина : екстрагент складає 1:10. Одержані екстракти об'єднують відстоюють при температурі +5 °С протягом 24 годин, фільтрують і випарюють у вакуумі при температурі 65 °С до отримання сухого продукту. Одержують 480 г сухого продукту. Вихід – 32 %. 6 Приклад 2. Протизапальну активність одержаного за заявленим способом екстракту, вивчали на моделі карагенінового набряку стопи у щурів, за антиексудативними властивостями екстракту, який досліджували у дозах 1 мг/кг, 2 мг/кг, 5 мг/кг та 10 мг/кг. Препаратами порівняння слугували альтан та вольтарен в ефективних дозах - 1 мг/кг та 8 мг/кг відповідно. Дослідження проводили на 6 групах стандартизованих білих щурів обох статей масою від 180 до 200 г по 6 тварин у групі. Набряк стопи у щурів викликали субплантарним введенням 0,05 мл 1 % розчину карагеніну в одну із задніх кінцівок тварин дослідних та контрольних груп через 1 годину після інтрагастрального введення досліджуваного екстракту у різних дозах та препаратів порівняння. Контрольна група щурів одержувала еквівалентну кількість води. Про розвиток набряку судили за загальним збільшенням стопи, який вимірювали через 1 годину (при максимальному розвитку запального процесу) за допомогою механічного онкометра за А. С. Захаревським. Протизапальну активність досліджуваних засобів визначали за здатністю зменшувати набряк стопи у дослідних тварин у порівнянні з контрольними. Розрахунок проводили за формулою: A VK  VA   100% VK ; де: А - протизапальна активність, % VK і VA - різниця об'ємів стопи до та після введення карагеніну у контрольній і дослідних групах. Результати дослідження наведено у таблиці 3. Таблиця 3 Протизапальна активність сухого екстракту з листя тополі китайської, одержаного за заявленим способом Варіанти досліду Контроль Альтан, 1 мг/кг Вольтарен, 8 мг/кг 1 мг/кг Сухий екстракт з 2 мг/кг листя тополі китай5 мг/кг ської 10 мг/кг Величина набряку, умовні одиниці 24,0±4,10 6,5±0,62 8,0±2,05 5,3±1,53 11,0±3,76 6,0±2,39 11,0±3,76 Активність, % 72,9 66,7* 75,8* 54,2 74,9* 54,2 Примітка: * - різниця достовірна у порівнянні з контрольною групою тварин (Р < 0,05). Отримані дані свідчать, що сухий екстракт з листя тополі китайської, одержаний за заявленим способом, виявив виражену протизапальну активність у дозі 1 мг/кг (76 %) та 5 мг/кг (75 %), яка більша ніж у альтану на 3 % та вольтарену - на 9 %. Приклад 3. Анальгетичну активність екстракту, одержаного за заявленим способом, вивчали на моделі "оцтовокислих корчів" на білих щурах, які були розподілені на 7 груп: дослідні; ті, яких лікували досліджуваним екстрактом у дозах 25, 50, 100, 150, 200 мг/кг; ті, яких лікували препаратом порівняння анальгіном, і контрольні. Анальгетичну активність оцінювали за здатністю зменшувати кількість "оцтовокислих корчів" і виражали у відсотках. Розрахунок проводили за такою формулою: 7 AA  95567 CK  CД  100% ; 8 СК і С Д - середня кількість корчів у тварин СК контрольної і дослідної групи. Результати досліду наведені у таблиці 4. де: АА - анальгетична активність, Таблиця 4. Анальгетична активність сухого екстракту з листя тополі китайської, одержанного за заявленим способом Варіанти досліду Контроль Анальгін, 55 мг/кг 25 мг/кг 50 мг/кг Сухий екстракт з 100 мг/кг листя тополі китайської 150 мг/кг 200 мг/кг Кількість корчів, М±m 30±4,22 9±1,25 10±2,05 11±1,02 10±2,05 14±3,76 9±2,39 Активність, % 70** 66** 63** 66** 53* 70** Примітка: * , ** - різниця достовірна у порівнянні з контрольною групою тварин (* Р < 0,05; ** Р < 0,001). Згідно з даними, наведеними у таблиці 4, екстракт з листя тополі китайської у дозах - 25, 50, 100, 200 мг/кг виявив виражену аналгетичну активність. У дозі 25 та 100 мг/кг вона була меншою за активність анальгіну на 4 %, а у дозі 200 мг/кг дорівнювала їй. Приклад 4. Вивчення діуретичної активності екстракту, одержаного за заявленим способом, властивостей проводили в умовах навантажувального діурезу на щурах. Досліджуваний екстракт у дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг, 150 мг/кг та 200 мг/кг одночасно з водним навантаженням, яке стано вило 3 % від маси тіла тварини, вводили внутрішньошлунково. Препаратом порівняння слугував гіпотіазид у ефективній дозі 40 мг/кг. Тварини контрольної групи отримували тільки водне навантаження (3 % від маси тіла), після чого усіх тварин контрольної та досліджуваних груп розміщували в індивідуальні клітки, в яких створені умови для збору сечі. Показником інтенсивності сечовиділення була кількість сечі, яку збирали протягом 3 годин. Кількість сечі, виділену контрольною групою тварин, приймали за 100 %. Результати досліду наведені в таблиці 5. Таблиця 5. Діуретична активність сухого екстракту з листя тополі китайської, одержаного за заявленим способом. Варіанти досліду Контроль Гіпотіазид Сухий екстракт з листя тополі китайської Доза, мг/кг Діурез, М±m 40 50 100 200 500 2,41±0,38 3,62±0,36 2,80±0,28 3,80±0,59 3,67±1,22 3,01±0,34 Активність по відношенню до контролю, % 50,2* 16,2 57,7* 52,3* 24,9 Примітка: * - різниця достовірна у порівнянні з контрольною групою тварин (Р < 0,05). Аналіз результатів визначення діуретичної активності (таблиця 5) показав, що екстракт з листя тополі китайської у дозах 100 мг/кг і 200 мг/кг проявляє виражену діуретичну активність, яка перевищує активність гіпотіазиду у дозі 40 мг/кг на 7,5 % і 2,1 % відповідно. Приклад 5. Вивчення гострої токсичності засобу, одержаного за заявленим способом, проводили на білих щурах експрес-методом визна чення середньосмертельних доз (ЛД50) хімічних речовин, який потребує незначних затрат часу і обмежену кількість тварин. Ефект оцінювався по загибелі (летальності) тварин при пероральному введенні екстракту. Результати вивчення гострої токсичності сухого екстракту з листя тополі китайської, одержаного за заявленим способом, наведені в таблиці 6. 9 95567 10 Таблиця 6. Гостра токсичність сухого екстракту з листя тополі китайської, одержаного за заявленим способом №п/п 1 2 3 4 5 6 7 Доза, мг/кг 2000 3000 5000 7000 10000 12000 15000 Кількість тварин 5 5 5 5 5 5 5 Отримані дані дозволяють констатувати, що LD50 досліджуваного екстракту становить більше 15000 мг/кг, що дає змогу віднести цю субстанцію, відповідно до класифікації К. К. Сидорова, до V класу токсичності - практично нешкідливих сполук. Таким чином, заявлено спосіб одержання засобу з листя тополі китайської, який проявляє виражену ефективну протизапальну, аналгетичну та діуретичну активність, є практично не токсичним і придатним до тривалого застосування. Заявлений спосіб простий, технологічний і може бути здійснений на звичайному хімікофармацевтичному підприємстві з використанням стандартного обладнання. Спосіб передбачає використання дешевої доступної сировини і забезпечує промислово доцільний вихід готового Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Летальність/Кількість тварин 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 продукту, який може бути використаний в якості активної діючої субстанції у складі фармацевтичних препаратів у різних лікарських формах. Джерела інформації: 1. Деклараційний патент на корисну модель 8568, Україна, МПК 7А61К35/78, заявл. 04.01.2005, опубл. 15.08.2005, Бюл. № 8. 2. Патент на винахід 2152797, Російська федерація, МПК 7А61К35/78, А61Р17/02, заявл. 02.06.1999, опубл. 20.07.2000, Бюл. № 20. 3. Патент на винахід 77347, Україна, МПК (2006) А61К36/185, А61К 127/00, А61Р29/00, А61Р31/00, А61Р13/00, заявл. 26.04.2005, опубл. 15.11.2006, Бюл. № 11. 4. Писанный Г. Г., Кулакова С. Г. Лекарственные деревья и кустарники юго-востока Украины. Донецк, 2006. - 170 с. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601