Спосіб діагностики гастроінтестинальних стромальних пухлин

Реферат: Спосіб діагностики гастроінтестинальних стромальних пухлин полягає у тому, що у видаленій пухлині оцінюють імуногістохімічним методом експресії CD117, CD34, SMA, десмін і S100. Додатково визначають наявність експресії маркерів наявність білків аноктаміну 1 DOG1, загальний м'язовий антиген MSА та маркер проліферативної активності Kі-67. UA 95693 U (54) СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ ГАСТРОІНТЕСТИНАЛЬНИХ СТРОМАЛЬНИХ ПУХЛИН UA 95693 U UA 95693 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель відноситься до медицини, насамперед до медичних нехірургічних способів діагностики пухлин, що може бути використано в онкології, патоморфології та гастроентерології для визначення гістогенезу та з'ясування прогностично сприятливих та несприятливих варіантів клінічного плину новоутворень шлунково-кишкового тракту, а отже використання індивідуально скоригованої терапії в залежності від достовірно верифікованого діагнозу з визначеним потенціалом злоякісності. Відомий спосіб діагностики гастроінтестинальних стромальних пухлин (ГІСП) [Заявка США № US2014065630, МПК C12Q1/68 заявл. 28.06.2011; опубл. 06.03.2014.], в якому шляхом виявлення та/чи аналізу in vitro у тестовому зразку плазми крові однієї чи декількох мутацій ДНК у одному чи обох характерних для ГІСП генів c-Kit (GenBank асc. no. NM_000222.2) та PDGFR-α (GenBank acc. no. NM_006206.4) проводиться верифікація вищезазначеного діагнозу. Таким чином відомий спосіб, використовуючи виявлені зміни у генетичному матеріалі, може бути застосований в якості панелі маркерів для діагностики та/чи моніторингу ГІСП чи визначення схильності до їх розвитку. Проте вищезазначений спосіб має значну вартість, тому його важко впровадити та забезпечити доступність у практичній охороні здоров'я у зв'язку з соціальноекономічними причинами. Також його специфічність знижує можливість досліджуваних мутацій призводити до розвитку інших онкологічних захворювань (наприклад, одна з діагностичних мутацій, що визначається у даному способі, а саме у кодоні 816 c-Kit, також визначається у мієлопроліферативних новоутвореннях). Найбільш близьким є спосіб діагностики гастроінтестинальних стромальних пухлин [патент Республіки Беларусь № BY 17291, МПК G01N33/574, заявл. 17.02.2010, опубл. 30.06.2013], який полягає у тому, що у видаленій пухлині оцінюють імуногістохімічним методом експресію CD117, CD34, SMA, десмін і S100. У відповідності з котрим ГІСП діагностують при наявності експресії CD117 і CD34, пухлину гладком'язового походження - за відсутності експресії CD117 і наявності експресії SMA і десмін або пухлину нейрогенного походження - за відсутності експресії CD117 і наявності експресії S100. Однак недоліком відомого способу є недостатня чутливість та специфічність вищезазначеної імуногістохімічної панелі маркерів, і визнаних дослідників проблематики ГІСП свідчить про те, що експресія маркеру CD117, що виявляє мутацію гену c-Kit, визначається лише у 80-90 % гастроінтестинальних стромальних пухлин, позитивна реакція з маркером CD34 у близько 70 % досліджуваних новоутворень. Таким чином близько п'ятої частини пухлин не діагностуються вищезазначеними маркерами, тобто використані маркери є недостатньо чутливими. З іншого боку показник гладком'язового походження SMA експресується у 30-40 % гастроінтестинальних стромальних пухлинах, що пояснюється походженням ГІСП та глаком'язових новоутворень із одного типу стовбурових клітин-попередників, та ускладнює діагностику ГІСП. Позитивна реакція з маркером нейроектодермального походження S100 також зустрічається у ГІСП - у 5-20 %, що пояснюється походженням досліджуваних новоутворень з клітин з нейрональною активністю клітин Кахаля - пейсмеркерів шлунково-кишкового тракту. Вищенаведені дані свідчать про недостатню специфічність використовуваних маркерів. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалити спосіб діагностики гастроінтестинальних стромальних пухлин шляхом зміни панелі досліджуваних маркерів: показників гістогенезу та проліферативної активності, застосування яких підвищить якість діагностики гастроінтестинальних стромальних пухлин, а отже підвищить виживаність пацієнтів. Поставлена задача вирішується тим, що в способі діагностики гастроінтестинальних стромальних пухлин, який полягає у тому, що у видаленій пухлині оцінюють імуногістохімічним методом експресії CD117, CD34, SMA, десмін і S100, відповідно до корисної моделі, додатково визначають наявність експресії маркерів наявність білків аноктаміну 1 DOG1, загальний м'язовий антиген MSA та маркер проліферативної активності Kі-67. Необхідність визначення у ГІСП наявність білків аноктаміну 1 DOG1 обґрунтовується високою чутливістю та специфічністю. За даними рандомізованого клінічного дослідження 1168 випадків загальна чутливість DOG1 склала 94,4 %, тоді як CD117-94,7 %. На користь високого показника специфічності говорить відсутність аноктаміну 1 у меланомі, саркомі Юинга, екстрамедулярних мієлоїдних новоутвореннях, у відмінності від CD117. Антитіло MSА виявляє різні форми м'язових мікрофіламентів клітини, а саме ізоформи актину α та γ. Таким чином, будучи маркером гладком'язового походження, його експресія визначається в нормі у м'язових клітинах мускулатури та стінок судин та в новоутвореннях: лейоміомах, лейоміосаркомах. Високу концентрацію γ-актину визначають у диференційованих гладком'язових клітинах кишечника, яка зберігається і у похідних з них неопластичних клітинах, що аргументує більшу специфічність і необхідність даного маркера у діагностичній панелі ГІСП. 1 UA 95693 U 5 Показник проліферативної активності Kі-67 дозволяє підрахувати справжню кількість клітини в стані мітозу на всіх його етапах, а також у підготовчій та завершальній фазах. Наявність ядерного забарвлення у більше 10 % пухлинних клітин вважається показником високої проліферативної активності. Пропонований спосіб діагностики гастроінтестинальних стромальних пухлин, який полягає у тому, що у видаленій пухлині, отриманій під час біопсії та оперативного втручання, імуногістохімічним методом оцінюють експресію маркерів CD117, CD34, SMA, десмін, S100, DOG1, MS А та Kі-67, детальні характеристики яких зазначені у таблиці 1. Таблиця 1 Характеристика первинних антитіл № 1 2 3 4 5 6 7 8 Первинне антитіло CD117 CD34 S100 SMA десмін DOG1 MSA Kі-67 Клон ab-1 ab-1 ab-1 ab-1 ab-1 sp31 ab-6 sp-6 Розведення 1:200 1:500 1:700 1:1000 1:100 1:100 1:100 1:100 10 15 20 25 30 35 40 45 Парафінові зрізи, товщиною 4 мкм, що насаджені на скельця з адгезивним покриттям, підлягають етапу демаскіровки: кип'ятіння у мікрохвильовій печі протягом 15 хвилин. Система візуалізації - Quanto (TermoScientific, США). Методика постановки імуногістохімічних реакцій згідно протоколів та рекомендацій компанії TermoScientific. У дослідженні використовують зразки новоутворень шлунково-кишкового тракту та екстрагастроінтетинальної локалізації неепітеліальної природи. Отриманий матеріал фіксують у нейтральному формаліні, аби уникнути хибно негативних реакцій з первинними антитілами, насамперед з CD 117. Наступним етапом виконують заливку у парафін з подальшим виготовленням гістологічних препаратів та забарвленням їх за стандартною методикою гематоксиліном та еозином та імуногістохімічним методом з використанням наступної панелі первинних антитіл CD 117, DOG1, CD34, S100, MSA, SMA, десмін, Kі-67, з наступною верифікацією діагнозу ГІСП. Позитивною реакцією для маркерів гістогенезу новоутворень CD117, DOG1, CD34, S100, MSA, SMA, десмін вважається наявність дифузного та/чи фокального різного ступеня інтенсивності цитоплазматичного та/чи мембранного коричневого забарвлення у більше 5 % неопластичних клітин. Для виключення технічних похибок проводять оцінку позитивного внутрішнього контролю для кожного з маркерів. Характер експресії показника проліферативної активності Kі-67 оцінюють за наявності ядерного коричневого забарвлення. Діагноз ГІСП верифікують на підставі визначення наступного морфофенотипу: позитивного статусу (+) маркерів CD117, CD34, DOG1 та негативного (-) S100, MS A, SMA, десмін. За наявності CD34та/чи DOG1- статусу та експресії CD 117, при негативній чи слабо позитивній реакції з маркерами S100, MSA, α-SMA, десмін також встановлюють діагноз ГІСП. У випадку CD117-, вагомим аргументом для постановки діагнозу ГІСП є DOG1+, CD34+ чи DOG1+ та негативна чи слабо позитивна реакція з маркерами S100, MSA, α-SMA, десмін. Якщо CD117-, CD34-, DOG1та визначають виражену експресію маркерів S100 та MSA, α-SMA, десмін діагноз ГІСП виключають та мають підстави для встановлення діагнозу нейроектодермального чи м'язового новоутворення відповідно. Визначення індексу проліферації більше 10 % свідчить про високу проліферативну активність пухлини, а отже високий ризик виникнення рецидиву та вторинного розповсюдження. Приклад 1. У пацієнта Б., 1964 р.н. у січні 2013 виявлено новоутворення заочеревинного простору великих розмірів. Після його видалення гістологічно встановлено діагноз мезенхімома, імуногістохімічне дослідження не проводилось. Через 7 місяців на комп'ютерній томограмі визначається рецидив новоутворення - пухлина у заочеревинному просторі. Після гістологічного дослідження матеріалу, отриманого після радикальної операції видалення новоутворення та резекції частини нирки, встановлено діагноз ліпосаркома. Під час проведення імуногістохімічного дослідження визначено: CD117+, CD34+, DOG1- та негативний статус маркерів нейроектодермального та м'язового походження, Kі-67-21 %. Що стало підставою для 2 UA 95693 U 5 10 15 20 25 верифікації діагнозу ГІСП з високою проліферативною активністю. Остання пояснює наявність рецидиву та свідчить про підвищений ризик виникнення повторного рецидиву та вторинних змін. Приклад 2. У пацієнта Д., 1961 р.н. у квітні 2009 року виявлено новоутворення шлунку та на підставі імуногістохімічного дослідження біоптата пухлини встановлено діагноз ГІСП з високою проліферативною активністю, з наступною гастректомією та формуванням езофагоеюноанастомозу, хіміотерапію не отримував. У липні 2010 року виявлено рецидив новоутворення - проведено резекцію товстого кишечника та підтверджено ГІСП. Після чого впродовж останніх років пацієнт приймає таргетну терапію іматінібом (Глівек) та відмічає стабільність стану здоров'я, що підтверджують регулярні обстеження комп'ютерним томографом. Приклад 3. Отриманий операційний матеріал шлунку пацієнта Д., 1963 р.н., було проаналізовано гістологічно та встановлено діагноз ГІСП, що передбачало ад'ювантну терапію дорогим та ефективним лише у випадку вищезазначеного новоутворення препаратом іматаніб (Глівек). Використовуючи імуногістохімічний метод дослідження, було отримано наступний морфофенотип: CD117-, DOG1-, CD34-, MSA-, α-SMA-, десмін- та виражена експресія S100, Kі67-7 %, що було розцінено, як шванома з помірною проліферативною активністю. Таким чином було виключено діагноз ГІСП, а отже покращено прогноз пацієнта та зменшено витрати на лікування. Вищезазначені приклади практичного використання способу діагностики гастроінтестинальних стромальних пухлин демонструють використання розширених молекулярно-біологічних характеристик мезенхімальних новоутворень черевної порожнини у діагностиці ГІСП. Дослідження повноцінної панелі імуногістохімічних маркерів, серед яких показники наявності білків аноктаміну 1 (DOG1), загального м'язового антигену MSA та маркеру проліферативної активності Kі-67 збільшило точність діагностики ГІСП та інформативність кінцевого результату на до- і післяопераційних етапах. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Спосіб діагностики гастроінтестинальних стромальних пухлин, який полягає у тому, що у видаленій пухлині оцінюють імуногістохімічним методом експресії CD117, CD34, SMA, десмін і S100, який відрізняється тим, що додатково визначають наявність експресії маркерів наявність білків аноктаміну 1 DOG1, загальний м'язовий антиген MSА та маркер проліферативної активності Kі-67. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3